胰腺癌基因诊断研究进展

    探讨对胰腺癌诊断有意义的基因指标。方法　复习国外有关胰腺癌基因诊断方面的文献。结果　K-ras、p53、DPC4和端粒酶基因可用于胰腺癌临床诊断。结论　胰腺癌相关基因的检测可用于胰腺癌的早期诊断。
　　
ADVANCES IN GENETIC DIAGNOSIS OF PANCREATIC CANCER

JIANG Jin-bo, XU.. Feng, SHOU Nan-hai.

　　(Department of General Surgery, The First Affiliated Hospital, Shandong University of Medical Sciences, Jinan 250012)

　　【Abstract】　Objective　To search for the significant gene indicators in the diagnosis of pancreatic cancer. Methods　Literatures about genetic diagnosis of pancreatic cancer were collected and reviewed. Results　K-ras, p53, DPC4 and telomerase genes were considered to play important roles in the diagnosis of pancreatic cancer. Conclusion　Detection of the genes related to pancreatic cancer may be of helpful in early diagnosis of pancreatic cancer.

　　【Key words】　　Pancreatic cancer　　Genetic diagnosis

　　胰腺癌发病率逐年升高，美国1997年死于胰腺癌的患者超过28 000人，列癌症死亡的第5位。胰腺癌确诊后平均生存时间不超过6个月，平均5年生存率低于5%。胰腺癌早期诊断困难，85%的患者出现症状时已发生淋巴结或远处转移，失去了手术时机〔1〕。近年来胰腺癌基因学研究取得了较大的发展，为胰腺癌的早期诊断和治疗开辟了新的途径。目前各国学者研究最多的胰腺癌相关基因是ras基因、p53基因、端粒酶基因和近年来发现的DPC4基因，现就此做一简要综述。

　　1　K-ras基因

　　K-ras基因是一种原癌基因，位于染色体12p12.1上，编码的p21蛋白具有重要的信息转导作用。突变后的ras基因所编码的蛋白会丧失灭活的功能，从而刺激细胞自发性生长和分化，导致肿瘤发生。K-ras突变见于80%～95%的胰腺癌中。大多数报道认为，K-ras突变与胰腺癌预后、分期无关。

　　1.1　胰液的应用

　　最初认为K-ras突变是与胰腺癌有关的特异性变化，可以作为判断胰腺癌存在的敏感标记物。最近研究发现，胰腺良性肿瘤〔2〕、慢性胰腺炎或胰腺囊肿中也存在较高的K-ras突变率，因此，不能仅依据K-ras突变来诊断胰腺癌。Tateishi等〔3〕于注射胰泌素后在内窥镜胆道造影(ERCP)下收集胰液检测，结果K-ras突变率在单纯性胰腺囊肿为43%(6/14)，胰腺癌中为50%(10/20)，导管内状瘤为60%(9/15)，在慢性胰腺炎为17%(1/6)。由于这种方法特异性较强，对于胰腺癌的筛选诊断有一定的实用性。

　　1.2　粪便的应用

　　Caldas等〔4〕用斑点杂交技术检测出胰腺癌患者粪便中K-ras突变率为55%(6/11)。与直接收集胰液相比，粪便中检出率较低。并且25%大肠癌和30%大肠腺瘤粪便中也可检出K-ras变异，所以这种方法的特异性不高。但由于简单易行，可用于胰腺癌的普查。

　　1.3　外周血浆的应用

　　此方法与上述方法相比，具有简单、无损伤、准确性高和可反复检测等优点。Hugh等〔5〕采用RFLP-PCR法检测到胰腺癌患者外周血浆K-ras突变率为81%(17/21)，5例健康人和3例慢性胰腺炎者均为阴性。4例疑诊患者在确诊为胰腺癌之前，其血浆均检出K-ras突变，而活检标本组织学检测和组织DNA检查均为阴性，直到确诊时才出现阳性。由此可见，血浆K-ras突变检测的敏感性高于常规肿瘤诊断方法，将来可望成为诊断胰腺癌的快速准确的方法。另一项研究发现，胰腺癌患者血浆K-ras突变率为57%(12/21)〔6〕，且K-ras基因突变阳性者的肿瘤比阴性者大，切除可能性小。手术及放化疗后血浆K-ras基因突变监测发现，持续阳性者复发早，提示这类患者预后差。可见这种方法还可用于评估肿瘤的大小、切除的可能性以及预后。另外，虽不能说血中微量癌细胞经血行后全部形成转移灶，但这种检查在辅助疗法选择上有一定的参考价值。

　　1.4　分子病理分期方面的应用

　　胰腺癌区域淋巴结的转移情况主要由常规病理决定。常规病理切片存在取样误差，且微转移或浸润灶不易识别。Demeure等〔7〕用PCR-RFLP法检测了22例胰腺癌的区域淋巴结，常规病理分期均为Ⅰ期(T1～2N0M0)。结果有至少一个淋巴结检测到K-ras突变的病例占73%(16例)。因此，可以通过检测K-ras突变来证实常规病理难以发现的淋巴结微转移，而淋巴结微转移是胰腺癌预后差的一个原因，并且辅助性放化疗可提高这类患者的生存率〔8〕。另外，这种分子病理学方法也可用于检测腹腔冲洗液、肝脏活检组织、肿瘤切缘的情况以及鉴别来源不明的转移癌。Inoue等〔9〕检测了17例胰腺癌患者的腹腔冲洗液以及随机肝穿刺标本，结果13例发现隐匿性肝转移，2例腹腔冲洗液阳性，而常规病理与细胞学检查均为阴性。可见分子病理学有助于胰腺癌准确分期，对选择治疗方案和判断预后有指导意义。

　　2　p53基因

　　p53基因位于染色体17p上，编码分子量53 kd的p53蛋白，突变的p53丧失了调节细胞周期的重要作用，导致肿瘤发生。在人类癌症患者中有半数可检出p53改变，大多数报告显示胰腺癌中p53突变率约40%～70%。因p53突变存在于多种肿瘤中，且在胰腺癌中突变率远低于K-ras基因，在某些良性胰腺疾病中也可出现阳性，故p53突变在胰腺癌诊断中应用有待于深入研究。

　　2.1　临床检测

　　变异的p53基因所编码的p53蛋白半衰期延长，用免疫组化法易于检出。据报道，37%～64%的胰腺癌组织中可检出p53蛋白过度表达，与p53突变率基本一致。所以，癌蛋白也可做为一种新的肿瘤标记物。Suwa等〔10〕对血清中p53蛋白浓度进行检测，发现胰腺癌血清中p53蛋白浓度显著超过健康人和慢性胰腺炎患者。胰腺癌远处转移患者的血清p53浓度显著高于无转移组。胰腺癌切除后的p53蛋白浓度比术前明显下降，说明血清中变异p53蛋白来自于肿瘤，且随着肿瘤的进展而升高，因此可用于胰腺癌的诊断，并可用于判断肿瘤的进展情况。另外，检测胰液p53蛋白和血清p53蛋白抗体也有助于胰腺癌诊断。

　　2.2　与预后的关系

　　关于p53蛋白过度表达与胰腺癌的预后方面报道结论不一致，多数学者认为p53蛋白阳性者预后差，生存期短。Lundin等〔11〕对133例胰腺癌研究后发现，p53蛋白过度表达与生存时间无关。Makinen等〔12〕发现，41%(24/59)胰腺癌过度表达p53蛋白，但与肿瘤分级以及所有的临床指标或结果无关。各家报道矛盾的原因尚待进一步研究。

　　3　端粒酶

　　研究发现癌细胞及生殖细胞中存在着延长端粒的端粒酶，能以自身RNA为模板合成端粒重复序列，即(5′-TTAGGG-3′)n。含有这种酶的细胞可逃避进行性端粒缩短而获得无限制的生长能力。人正常体细胞端粒酶活性均为阴性，而90%左右的恶性肿瘤细胞端粒酶呈活化状态，因此它与以往报道的基因标记物相比有较高的特异性。然而研究也证实末梢淋巴细胞、肠管上皮细胞、造血干细胞等具有自我增殖能力细胞中也存在阳性端粒酶表达。因此单独以端粒酶活性的存在并不能简单断定癌细胞的存在。内部端粒酶标准定量对比研究发现，癌细胞的活性是正常细胞的10～100倍〔13〕，因而定量化比较端粒酶活性对癌细胞诊断更有重要的参考价值。Hiyama等〔14〕报道95%(41/43)的胰腺癌组织中端粒酶活性呈阳性，而11例良性胰腺肿瘤均呈阴性。36例癌旁组织中，仅5例呈弱阳性，其中2例病理证实有癌细胞微浸润。此结果提示，端粒酶在正常胰腺和良性胰腺疾病时处于抑制状态，而在胰腺癌中重新激活，表明端粒酶活化在胰腺癌发生中起重要作用，可以作为诊断胰腺癌的基因标记物。另有作者〔15〕报道，检查胰液中脱落细胞的端粒酶活性是诊断胰腺癌的较好而且较早的方法。

　　4　DPC4基因

　　DPC4基因是近年来发现的一种新的抑癌基因，位于染色体18q21.1上，编码的Smad4/DPC4蛋白是TGF-β传递信号到细胞内途径的一个成员，而转化生长因子β(TGF-β)可抑制细胞的生长，所以DPC4缺失可促进细胞过度生长〔16〕。最近研究发现〔17〕，p21 WAF1可能参与这个过程的发生。约50%的胰腺癌有DPC4的丢失或失活，其中约30%为纯合性丢失，约20%为点突变〔18〕，DPC4在其他肿瘤中的失活率通常小于10%，可见DPC4基因丢失或失活在胰腺癌发生中具有特异性，可作为一种新的胰腺癌标记物。

　　5　其他基因与肿瘤标记物

　　p16抑癌基因位于染色体9p上，编码的p16蛋白是一种CDK4的抑制物。在约80%的胰腺癌中失活。其他与胰腺癌发生有关的基因还有APC、DDC、Rb-1、C-erbB-2、nm23、DNA错配修复基因等，这些基因在胰腺癌中表达率较低，故不能单独作为胰腺癌基因用于诊断。另外，血清肿瘤标记物(如CA19-9，CAM17.1，胰岛淀粉样肽等)检查也是胰腺癌诊断的常规方法之一，虽然其敏感性和特异性不高，但由于这一方法快速简便，其研究仍在不断深入。

　　6　联合检测与胰腺癌变分子机理的研究

　　恶性肿瘤发生都是多阶段多步骤的，需要多个基因改变的连续性累积，一般需要3～7个基因突变。有关胰腺癌恶性转化过程尚未完整阐述，但这方面研究进展非常迅速。Rozenblum等〔19〕报道，77%(30/39)的胰腺癌中可以检出3种或4种基因突变，说明胰腺癌中同时存在多种基因改变，这对于胰腺癌的鉴别诊断可能有一定的价值。也揭示了胰腺癌恶性程度高的部分分子基础。Apple等〔20〕对胰腺癌和非胰腺癌标本的正常上皮，导管上皮增生，不典型增生和浸润癌分别进行免疫组化染色，观察K-ras、p53以及HER-2/neu(C-erbB-2)基因产物的表达情况，结果发现胰腺癌变过程中进行性累积了基因突变，证实了多步癌变假说。还可以看出癌变过程中各种分子事件发生的顺序： K-ras突变和HER-2/neu突变发生较早，是相对早期事件，而p53突变发生在不典型增生向癌转化附近，为相对晚期事件。虽然导管增生与不典型增生在非胰腺癌中比较少见，但基因改变与胰腺癌完全相同，说明导管上皮增生及不典型增生即是胰腺癌的癌前病变，这些个体将来发生癌变的可能性较大。也说明在基因改变与病理关系上，胰腺癌与非胰腺癌是没有区别的。因此，联合检测在筛选高危人群，明确癌变进程，早期诊断等方面有应用价值。更重要的是应用基因工程的方法来校正这些变异基因，可达到治愈肿瘤的目的。

　　综上所述，在胰腺癌诊断上，目前还没有有效的筛选方法，也缺乏单一可靠的诊断方法。近年来，有关胰腺癌基因学方面的研究进展很快，利用分子生物学技术检测这些基因改变，有希望成为一种新的诊断方法。此外，通过对胰腺癌变分子机理的研究，可望为今后胰腺癌的早期探测、预防以及治疗提供理论依据。