肝纤维化模型

   【摘要】 肝纤维化是多种慢性肝病发展至肝硬化的共同病理学基础，虽然对肝纤维化的研究已从细胞水平进入分子水平，但肝纤维化动物模型的建立，仍是临床研究和实验研究的重点和难点。本文就数种肝纤维化模型的建立方法加以综述，并对各种模型的优、缺点和各自用途进行比较，提出了肝纤维化动物模型的研究方向。

    【关键词】 肝纤维化 模型 动物

    肝纤维化是各型病毒性肝炎和某些肝病的病理特征，是慢性肝炎发展为肝硬化的必经阶段。目前，普遍认为，此阶段病理过程可逆。寻找有效药物阻断肝纤维化的发生和发展，是国内外研究的热点。建立合适的肝纤维化动物模型，是研究肝纤维化发生机制、筛选护肝药物的前提。近年来，肝纤维化动物模型研究取得了可喜的成就。现将其研究进展综述如下。

     1 化学药物或毒物所致肝纤维化实验动物模型

    肝细胞对许多化学药物或毒物敏感，通过化学药物或毒物对实验动物造成不同程度、不同性质的肝损伤模型是最常用的方法。

    1.1 四氯化碳中毒性肝纤维化动物模型 它是最早、最广泛应用、最能诱导肝纤维化动物模型的化学毒物。高浓度的CCl4主要累及中枢神经系统，而低浓度长期反复染毒则易损害肝、肾。其作用机理是：在肝细胞内质网中，CCl4通过肝微粒体细胞色素P450氧化酶激活后生成三氯化碳(-CCl3)，CCl3与肝细胞内大分子发生共价结合，破坏肝细胞功能。此外，CCl3还可攻击肝细胞膜的磷脂，引起脂质过氧化破坏膜性结构，损伤肝细胞，从而导致狄氏间隙内原本静止的贮脂细胞活化，释放IV型胶原酶，降解IV型胶原。肝细胞从合成分泌IV型胶原为合成分泌I型胶原，取代了IV型胶原，促使肝脏纤维化[1]。造膜途径多样化，形成肝纤维化模型时间也与给药途径不同而有差异，时间6～16周不等。王晓红等[2]给大鼠皮射60%CCl4植物油溶液0.3ml/100g，2次/周，发现大鼠肝脏炎症和纤维组织增生程度随实验时间延长逐渐加重，20周后正常肝小叶结构消失，假小叶形成。郭美姿等[3]用60%CCl4植物油液给大鼠灌胃。首次0.5ml/100g，以后0.2ml/100g，2次/周，共6周，同时给与5%乙醇。见广泛肝细胞变性坏死，纤维组织明显增生，形成假小叶。Montfort et al[4]取Wistar大鼠，用浓度40%CCl4，按2ml/kg体重给予大鼠腹腔注射，每周2次，共8周，见肝小叶间结缔组织明显增多，出现由再生肝细胞形成的假小叶。用CCl4攻击建立的肝纤维化模型，具有简便、易行、价廉且耗时短的特点。在形态学、病理生理学的某些方面与人肝纤维化相似，已广泛用于研究肝纤维化发生的细胞及分子机制、血清学标志物与组织病理的相关性及抗纤维化的药效评价，但有死亡率高，停止造膜给药后，有一定自然恢复趋势的特点。

    1.2 致癌物致肝纤维化动物模型 低剂量长期应用致癌物可引起肝纤维化，常用二甲基亚硝胺(DMN)、硫代乙酰胺(TAA)等。DMN通过肝微粒体代谢其中间产物与核酸、蛋白质等结合导致肝细胞损伤，同时产生的活性甲基化产物使核酸、蛋白甲基化导致肝坏死[5]。TAA通过影响蛋白合成及肝细胞中酶的代谢诱导肝损伤。李春辉等[6]给雄性Wistar大鼠腹腔注射DMN(10μl/kg)，每周注射3天，4周后肝广泛纤维化。张杰等[7]给大鼠0.03%的TAA诱导5周，再改为0.04%TAA诱导饲喂5周，10周后间肝内假小叶广泛形成。该模型简单可靠，造模时间短，肝纤维化模型成功率高且形成相对稳定，在组织学和生化代谢的变化上与各种病因引起的人类肝硬化改变很相似，该模型实用于肝纤维化发生机制的研究及肝硬化向肝癌转化的机理研究。但DMN、TAA的毒性大，易挥发，实验操作过程中应加强个人防护。

     2 慢性酒精中毒性肝纤维化动物模型

    酗酒是当今世界的严重问题，它不仅造成各种社会危害，还可引起酒精性肝病。酒精引起肝纤维化的主要机制是：进入肝内的酒精在乙醇脱氢酶和微粒体乙醇氧化酶系的作用下转变为乙醛，再转变为乙酸。后一反应使辅酶I(NAD)转变为还原型辅酶I(NADH)，导致NADH对NAD比值增高的效应，从而抑制肝线粒体三羧酸循环[8]，进而脂肪氧化减弱，肝内脂肪酸合成增加，当其增多超过肝脏的处理能力就形成脂肪肝，最终形成肝纤维化。周宁等[9]给大鼠按每周所测得的体重给与酒精体液分数为0.56的白酒7g/kg灌胃，每日晨1次，持续24周。实验期间均予全价营养颗粒饲料喂养，自由进食进水。4周出现中央静脉壁周围胶原稍增多，窦周纤维化，24周肝小叶内出现纤维分隔。实验结果表明，大鼠肝纤维化程度与实验时间长短成正比。该模型科学可行且死亡率低(18.18%)，一般用于酒精性肝病的研究。

     3 营养不良性肝纤维化动物模型

    该模型是通过膳食不平衡或特种营养素缺乏引起动物肝脂变渐渐形成肝纤维化。如高脂低蛋白低胆碱性膳食，胱氨酸、维生素E缺乏或加入乙硫氨酸等。用缺乏胆碱和蛋氨酸低蛋白高脂饲料喂养幼年大鼠可造成脂肪代谢障碍，3个月可发展为脂肪性肝纤维化，并且与人酒精性肝纤维化相似。该模型适合研究饮食脂肪含量与胆碱缺乏和肝纤维化的关系。

     4 实验性免疫建立肝纤维化模型

    该模型形成机制是免疫复合物所致的Ⅲ型变态反应。主要在肝脏门脉汇管区形成免疫复合物沉积，由沉积的免疫复合物引起局部炎症反应，进一步刺激胶原的增生而造成肝纤维化。董忠[10]等通过腹腔注射人血清白蛋白建立免疫损伤性大鼠肝纤维化模型，给雄性大鼠(体重110～120g)皮下多点注射人血清白蛋白(共4次)，10天后腹腔注射人血清白蛋白(每周2次，共8周，剂量从5mg逐渐增至20mg)，可见肝组织界板区肝细胞变性，坏死，炎性细胞浸润，汇管区及小叶间纤维组织增生，纤维化模型形成率100%，持续时间120天以上。此外，还可采用动物血清白蛋白如牛血清白蛋白致免疫损伤性肝纤维化动物模型[11]。由于此类模型是一种免疫性损伤，造成的肝纤维化与临床上的慢性肝炎所致肝纤维化在发生机制上更加接近，为一种理想的模型。在研究肝纤维化发生机制、早期诊断以及评价药物疗效等方面应用较多。

     5 胆管阻塞性肝纤维化模型(BCM)

    BCM在大鼠、兔、犬和猴等动物取得成功。该法是通过切断胆管或注入硬化剂等方法造成肝外胆道梗阻，引起梗阻以上胆汁淤积，肝内血管受压，肝细胞缺血坏死，纤维组织增生向胆管伸展，包绕肝小叶，形成肝纤维化。造膜方法简单，周期短。大鼠6周左右即可形成肝纤维化。尹珊珊等[12]随机予大鼠进行单纯胆管结扎、胆管结扎与切断、及胆管内逆行性注入TH胶加胆管结扎造成胆管阻塞的结果表明：后一种方法较前两种方法更稳定，表现在术后2周时，单纯结扎的大鼠全部胆管再通，6周时，胆管粘堵组胆管再通的大鼠明显少于胆管切断组。此模型纤维化形成快，4周时可见围绕增生的胆小管周围增生的纤维组织分割肝小叶，另外，炎症反应轻，肝细胞坏死不明显。阻塞后16周，病理组织学上仍可见明显的纤维化，且肝纤维化的进展与血清中酸性前胶原蛋白的增加相关性明显，可作为肝纤维化生物指标测量的理想模型。

     6 病证结合肝纤维化动物模型

    病证结合是中西医结合的重要环节，既辨证又辨病，病证结合中西医结合动物模型对临床病理研究与中医证候本质研究具有一定参考价值[13]，尤其对中医药防治疾病研究可提供客观疗效判定和用于探讨药理作用。

    6.1 血吸虫病蛊胀模型 郭振球等[14]经小白鼠腹部皮肤人工感染日本血吸虫尾蚴10条，第七周用吡蝰酮全剂量杀虫，制成模型。肉眼看腹部肿大，青筋显露，腹壁静脉充血，打开腹腔后，有少量腹水，肝脾明显肿大，肝脏呈紫色，包膜充血，颜色紫暗，肝脏表面布满灰白色粟粒样结节。镜下脾髓索内有嗜酸性细胞浸润，肝脏汇管区有虫卵结节及纤维结缔组织增生，肝组织淋巴细胞、单核细胞及嗜酸性白细胞浸润。此模型既具备肝纤维化病理特征，又符合中医虫瘀证候表现，病证结合得到很好的体现。可用来进行中医药治疗蛊胀的药效学及病因病机研究，有较好的应用前景。

    6.2 血瘀型肝纤维化大鼠模型建立 张斌等[15]采用复合多因素的建模方法，在二甲基亚硝胺(DMN)制作大鼠肝纤维化模型的同时，多次静脉给予去甲肾上腺素和小牛血清白蛋白综合造模。造膜结束时血瘀组大鼠出现明显血瘀证候，表现为舌质青紫瘀斑，舌下静脉曲张，体重减轻，毛发无光泽易脱落、易激惹、抑郁等情绪异常表现，极好地模拟了临床上肝病患者肝郁的特征。肝脏病理学观察表明，血瘀组肝纤维组织增生，纤维间隔加宽，肝窦明显扩张瘀血，出现典型的肝纤维化。本研究采用多因素方法成功复制了血瘀型肝纤维化病证结合动物模型，模型既具备肝纤维化病理特征，又符合中医血瘀证证候表现。此模型可用于血瘀证实质的探讨及活血化瘀方药作用的研究[16]。除了以上这些造模外，多因素致动物肝纤维化造模是目前常用方法，可节约时间，提高成功率与降低死亡率。如CCl4加乙醇[17]，CCl4加人造血清白蛋白[18]。综上所述，我们需要根据不同的实验目的和需要来选择最适合的肝纤维化动物模型。但理想的纤维化动物模型应与人类疾病特征相似，且造膜方法简单，模型形成率高，重现性好，由于肝纤维化的病因多样化，动物与人种属的差异性，迄今为止，模型制作尚未完全取得成功。所以今后应进一步加强肝纤维化模型的研究。展望未来，我们相信通过设计转基因制模是发展的趋势。

     参考文献

    [1] 刘克辛.抗肝疾患药物开发的工具：肝疾患基础及其实验动物模型[M].北京：中国医药科技出版社，2003：44-45

    [2] 王晓红，张卫光，等.CCl4诱导性肝硬化大鼠肝组织葡萄糖调节蛋白78表达的研究[J].解剖学报，2006：6

    [3] 郭美姿，李素生，沈鼎明，等.大黄酸对大鼠肝纤维化形成的影响[J].中国肝脏病杂志，2003，11(1)：26

    [4] Montfort I，Perez Tamayo R.Collagenase in experimental carbon tetrachloride cirrhosis of the liver[J] .Am J Pathol，1997，92：411

    [5] 郭花，薛挥.肝硬化动物模型研究进展[J].中国比较医学杂志，2006：8

    [6] 李青辉，潘理会，等.二甲基亚硝胺诱发大鼠肝纤维化发生机理的研究[J].承德医学院学报，2006，23(23)

    [7] 张杰，陈积圣，等.硫代乙酰胺诱导肝硬化模型方法的改进[J].中华实验外科杂志，1999，6

    [8] 李玉林.病理学[M].北京：人民卫生出版社，2004：205

    [9] 周宁，厉有名，等.大鼠酒精性肝纤维化模型的构造[J].东南大学学报(医学版).2003，22(2)：93-97

    [10] 董忠，刘瑾，等.大鼠腹腔注射人血清白蛋白免疫性肝纤维化模型的实验研究[J].中华实验和临床病毒杂志，2006，3

    [11] 朱起贵，方步武，吴贺算，等.牛血清白蛋白致免疫损伤性肝纤维化动物模型的研究[J].中华病理学杂志，1993，22(2)：121

    [12] 严珊珊，王宝恩，等.胆管阻塞性肝纤维化模型的建立与改进[J].中华肝脏病杂志.2002，10(5)：385-386

    [13] 阎珊珊，窦维华，董少龙，等.血瘀证动物模型的制作及存在问题的探讨[J].中国中医基础医学杂志，2004，10(2)：35-37

    [14] 郭振球，杨运高，等.血吸虫病蛊胀模型之研究[J].湖南中医学院学报，1996.(16)：1

    [15] 张文武，王中华，等.血瘀型肝纤维化大鼠模型的建立与评价[J].中西医结合肝病杂志，2006，16：155-157

    [16] 武继彪，随在云，许复郁.慢性血瘀动物模型的建立及其血液流变学的变化[J].中医药理与临床，2001，17(5)：45-46

    [17] Hung DY，Chang P，Cheung K，et al.Quantitative evaluation of altered hepatic spaces and membrane transport in fibrotic rat liver[J].Hepatology,2002,36(5):1180-1189

    [18] 李建军，王宝思，董受力.实验性肝纤维化过程中肝内I、Ⅲ型胺原的动态变化[J].中华医学杂志，1988，66(7)：374

    作者单位：盐城卫生职业技术学院病理教研室(江苏)

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