肝门部胆管癌

   摘要　目的：研究肝门部胆管癌中细胞凋亡和血管形成的相互关系。方法：采用原位末端标记技术和抗因子Ⅷ的抗体分别检测肝门部胆管癌细胞凋亡指数和瘤内微血管的密度，同时用免疫组化法检测血管内皮细胞生长因子(VEGF)和胆管癌细胞凋亡调控基因bcl-2的表达。结果：肝门部胆管癌组织VEGF阳性表达率55.56%(20/36)，VEGF阳性表达与MVD呈正相关(P＜0.01)。高血管组的bcl-2阳性表达明显高于低血管组(P＜0.05)，而低血管组的细胞凋亡指数高于高血管组(P＜0.01)。bcl-2表达丰富的区域，VEGF的表达率高。结论：肝门部胆管癌血管形成影响细胞凋亡的敏感性和发生率。

　　目前研究认为，肿瘤血管是肿瘤生长和转移的形态学基础，肿瘤血管生成受到肿瘤细胞释放的血管生长因子(VEGF)等的调控。无血管生成的肿瘤组织可能数月、数年不增殖，许多血管生成抑制剂通过提高细胞凋亡比率抑制实验性肿瘤的增殖和转移〔1〕。近年来发现，细胞增殖与细胞凋亡不平衡病理状态与肿瘤的发生发展密切相关〔2〕。但是，对于胆囊肿瘤内的MVD和自发性细胞凋亡在胆囊癌发生发展中的作用，以及它们之间关系的研究报道甚少。为此，本研究通过观察肝门部胆管癌中的MVD、VEGF及bcl-2和细胞凋亡指数，以探讨血管生成、细胞凋亡及调控基因在肝门部胆管癌发生中的作用及相互关系。

材料与方法

　　1.病例及组织标本：收集同济医院、山东省肿瘤医院1996年9月至1998年12月手术切除的肝门部胆管癌组织标本36例，其中男26例，女10例，年龄38-73岁(中位年龄52.4岁)。Bismuth Ⅰ型14例，Ⅱ型10例，Ⅲ型8例，Ⅳ型4例；≥2cm 26例，＜2cm 10例；组织学检查：管状腺癌16例，状腺癌12例，未分化癌6例，粘液癌2例；分化程度：高分化15例，中分化8例，低分化13例；有淋巴结转移占61.1%(22/36)。术后立即将部分肿瘤和癌旁组织投入液氮，-80℃保存备用，其余部分经10%甲醛固定，石蜡包埋后制成4μm连续切片备检。
　　2.试剂：鼠抗人因子Ⅷ相关抗原(FⅧR Ag)单克隆抗体(Dako)公司，VEGF多克隆抗体(Santa Cruz公司)，LSAB kit (Dako公司)，bcl-2单克隆抗体(Santa Cruz公司)，细胞凋亡检测试剂盒(北京中山生物公司)。细胞凋亡检测采用ISEL法，NBT显色；MVD、VEGF及bcl-2采用SLAB法免疫组化染色，操作按说明书进行，DAB显色。用肝癌组织作阳性对照，PBS代替一抗作为阴性对照。
　　3.结果判定：细胞核内呈蓝色反应者为凋亡细胞。每一病例的切片在非坏死区的5个区域计数3?000个细胞，凋亡细胞在所有计数细胞中所占的百分比为凋亡指数。bcl-2以细胞浆染成棕黄色颗粒为阳性。按5%以上细胞浆或细胞膜呈棕黄色染色为VEGF阳性〔3〕。MVD记数参照Maeda〔4〕报道方法，计算5个视野内微血管数，取其平均数作为该病MVD值。
　　4.统计与分析方法：χ2、精确概率法、t检验。

结果

　　1.肝门部胆管癌组织中MVD和VEGF表达：肝门部胆管癌组织中所有毛细血管、小静脉和小动脉内皮细胞为FⅧR Ag染色阳性，分布具有异质性，肿瘤边缘多于肿瘤内部。36例肝门部胆管癌组织MVD平均为(35.6±9.8)个，VEGF阳性表达率55.56%(20/36)，其表达也具有明显的异质性，强阳性染色的癌细胞多位于浸润前缘，内皮细胞也呈弱阳性染色，周围正常粘膜未见VEGF阳性表达。VEGF阳性表达与MVD呈正相关(P＜0.01)。
　　2.凋亡细胞及bcl-2表达：肝门部胆管癌组织中的细胞凋亡率为88.33%(30/36)，凋亡指数0.28%-8.60%，平均为(3.46±0.62)%。高分化腺癌中的凋亡细胞数明显高于低分化腺癌及转移癌，并且呈片状或块状分布。bcl-2在肝门部胆管癌中阳性表达率为44.44%(16/36)。bcl-2染色阳性者凋亡细胞数明显少于bcl-2阴性者(P＜0.05)。
　　3.MVD与细胞凋亡的关系：肝门部胆管癌中的MVD值中位数为130个，按此界限分为高血管组(MVD＞130，16)，低血管组(MVD≤130，20)。高血管组的bcl-2表达明显高于低血管组(P＜0.05)，高血管组的凋亡细胞指数显著低于低血管组(P＜0.01)。bcl-2表达丰富的区域，VEGF的表达高，即VEGF表达丰富的区域，凋亡的敏感性降低。

讨论

　　肿瘤血管生成是肿瘤生长的物质基础，无血管生成的肿瘤可数年不生长，呈休眠状态，一旦血管开始形成，肿瘤组织则具有快速增殖和转移的能力〔5〕。细胞凋亡与细胞增殖是反映细胞生长的两个方面，凋亡与增殖的不平衡状态是肿瘤形成的基础〔6〕。有关肝门部胆管癌中血管生成与细胞凋亡相关性的研究目前国内外尚未见报道。
　　肿瘤血管生成受到肿瘤细胞分泌的血管生长因子的调控。VEGF是诱导肿瘤血管生成作用最强的生长因子。研究表明〔7〕，许多肿瘤组织中有VEGF高表达，并且和MVD值的增高呈正相关。本研究显示，36例胆管癌组织中VEGF阳性表达者MVD平均值明显高于阴性者，VEGF的表达部位与MVD的分布也具有一致性。同时发现，抗凋亡基因bcl-2的表达和凋亡指数的检测结果表明，血管形成丰富的区域，bcl-2基因表达率高，而凋亡指数低，即胆管癌细胞凋亡的敏感性和发生率降低，因此肝门部胆管癌组织中血管形成与自发性细胞凋亡成负相关。本实验结果与Lu等在胃癌中血管形成与细胞凋亡的研究结论相一致〔1〕。
　　肿瘤的发生不仅依赖于细胞的增殖，也依赖于细胞凋亡的发生。血管形成是一个引起新血管发生的过程，肿瘤的生长和转移依赖于血管形成，低氧、细胞因子、激素和蛋白激酶C(PKC)的调控因子能够通过细胞内的信号途径调节VEGF的表达。目前研究已证实，肿瘤的血管形成是肿瘤发生和发展的早期事件，而肿瘤细胞的自发性凋亡受到瘤组织中新生血管化程度的显著影响。本研究表明，肿瘤的血管形成可降低肿瘤细胞的凋亡，推测氧调节在二者中起着重要的调节作用〔8〕。
　　肿瘤的血管形成和肿瘤细胞的凋亡是两个既相互独立又有着某种联系的事件，在肿瘤发生和发展的过程中，肿瘤细胞的凋亡和血管形成具有重要的生物学作用。因此综合分析二者的相互关系，有助于判断肿瘤的预后，同时也为肝门部胆管癌抗血管生成治疗提供了理论基础。相信在胆道癌抗血管生成药物治疗过程中，随着对血管生成和细胞凋亡的动态研究，抗肿瘤血管生成治疗将会成为肝门部胆管癌理想的治疗途径。