乙肝病毒核心区基因变异与细胞免疫

李嘉  朱理珉  梁树人  李顺天  徐健
【摘要】  目的  探讨慢性乙型肝炎患者乙型肝炎病毒（HBV）核心区Leu60Val变异与机体细胞免疫水平的关系。 方法  通过流式细胞分析技术（FCM）检测外周血T淋巴细胞亚群，利用酶联免疫吸附试验（ELISA）检测血清细胞因子［干扰素γ（IFN-γ）、肿瘤坏死因子α（TNF-α）和白细胞介素2（IL-2）]水平，采用聚合酶链反应（PCR）扩增HBV DNA C基因区片段，并对PCR产物直接测序。 结果  91例慢性乙型肝炎患者发生Leu60Val变异者19例，变异率为20.9%，随病情加重变异率逐渐增加，以重型肝炎组最高；Val60变异株组IFN-γ、TNF-α水平明显增高（t值分别为2.584、4.766，P<0.01），CD4+ /CD8+比值逐渐升高（t＝2.275，P<0.05）。 结论  Val60变异株可能通过增加与Ⅰ类人白细胞抗原（HLA-I）的亲和力，或上调HLA-I类分子的表达，从而激活大量的细胞毒性T淋巴细胞释放细胞因子，并同时在肝脏局部发挥免疫效应，提高对宿主的杀伤力。

【关键词】  肝炎病毒，乙型； 变异； 细胞因子； T淋巴细胞亚群； 序列

Relationship between the HBV core gene mutation and the cellular immunity in host  LI Jia, ZHU Li-min, LIANG Shu-ren, LI Shun-tian, XU Jian. Tianjin Infectious Diseases Hospital, Tianjin 300192, China
【Abstract】    Objective    To study the relationship between the mutation of Leu60Val in HBV core region and the cellular immunity in patients with chronic hepatitis B (CHB). Methods    HBV DNA C gene mutation was confirmed by polymerase chain reaction (PCR) and sequencing the products directly. The cytokines (IFN-γ, TNF-α and IL-2) levels in serum were measured by enzyme linked immunosorbent assay (ELISA). The distribution of T-lymphocyte subpopulations in peripheral blood was detected by flow cytometry (FCM). Results    The mutation of Leu60Val was found in 19 out of the 91 CHB patients. With the CHB severity, the mutation rate was getting higher, especially in the severe hepatitis group. The IFN-γ and TNF-α levels were much higher in mutant strain group than those in wild strain group (t = 2.584, 4.766, P < 0.01), so was the ratio of CD4+/CD8+ (t = 2.275, P < 0.05). Conclusion    The mutant strain of 60Val may increase affinity to HLA-I molecule, or up-regulate the expression of HLA-I molecule, resulting in the activation of CTL to release the cytokines and cause immune response in liver.
【Key words】    Hepatitis B virus;  Mutation;  Cytokines;  T-lymphocyte subpopulations;  Sequence

　　慢性乙型肝炎患者的肝细胞损伤主要是由于机体针对乙型肝炎病毒（hepatitis B virus，HBV）发生的免疫反应所引起，其中作为效应细胞的CD8+细胞毒性T淋巴细胞（cytotoxic T lymphocyte，CTL）是肝细胞发生病理损害的主要介导者，而针对HBV核心抗原（hepatitis B core antigen，HBcAg）的CTL应答是决定病毒是否被清除的关键。当HBV基因发生变异，可以改变氨基酸分子的表达，尤其当CTL识别的重要表位发生变异会改变机体针对病毒的免疫反应。本实验通过对HBV DNA C基因区进行核苷酸序列分析，并同时检测患者外周血T细胞亚群（CD4+、CD8+）及血清细胞因子水平［γ干扰素（interferon γ，INF-γ）、肿瘤坏死因子α（tumor necrosis factor α，TNF-α）及白细胞介素2（interleukin 2，IL-2）］，从而了解HBV核心区第60位亮氨酸变异为缬氨酸（Leu60Val）的情况及机体的免疫状况，探讨在慢性乙型肝炎中，HBV核心区Val60变异株与机体细胞免疫水平的关系。

资料与方法

1．病例选择：病例为天津传染病医院1999年10月～2001年10月收治的91例慢性乙型肝炎患者，其中轻度21例，年龄（34.95±11.38）岁；中度24例，（36.05±13.45）岁；重度23例，（35.45±10.47）岁；重型肝炎23例，（39.71±12.20）岁。血清甲、丙、丁、戊、庚型肝炎病毒血清学标志检测均阴性。诊断符合符合2000年西安修订的病毒性肝炎诊断标准[1]。

2．HBV DNA C基因区扩增及序列分析：根据GeneBank公布的31条HBV全基因序列，选取C基因区两端保守区域，设计合成2条特异性引物（C1和C2）进行PCR扩增，并经Pcrdesn软件进行检验，测序引物为C3。引物由上海生工生物工程有限公司合成。引物C1 5′-TGGAGACCACCGTGAACGCC-3′（nt 1609～1628），C2 5′-AAAGACAGGTACAG TAGAAG-3′（nt 2516～2497），C3 5′-GGCGAG GGAGTTCTTCTTCTAGGGG-3′（nt 2364～2388）。dNTP为美国Gibco公司产品，Taq DNA聚合酶、Tris饱和酚购于北京鼎国生物技术发展中心，DNA测序试剂盒为加拿大Visible Genetic公司的末端标记试剂盒及OpenGene 自动DNA测序仪和Version 3.0进行DNA测序电泳及序列分析。提取血清DNA，采用PCR扩增HBV DNA C区基因，电泳后在紫外光下检测PCR产物，采用琼脂糖凝胶电泳回收法回收产物，并进行产物的纯化，采用双脱氧链末端终止法进行测序反应，对测序产物纯化后进行测序电泳。

3．血清细胞因子检测：IFN-γ、TNF-α和IL-2试剂盒购自美国Gibco公司。采用双抗体夹心酶联免疫吸附法检测，一抗为生物化学抗体，二抗为辣根过氧化物酶标记的streptavidin，用标准品绘制曲线并计算429nm吸光度时标本浓度。

4．外周血T细胞亚群的检测：采用流式细胞术，选用三色荧光标记的免洗试剂（TriTESTTM CD4 FITC+CD8PE+CD3PerCP）直接荧光染色。荧光标记试剂、红细胞裂解液及同型对照均为美国BD公司的产品。取抗凝血1ml，先将白细胞数调至（4.0～10）×109/L，在管底部加入CD3/CD4/CD8三色直标荧光抗体20μl和混匀的肝素抗凝血100μl，彻底混匀后室温避光30min。加１×红细胞裂解液1ml于试管内充分混匀，室温避光保存15min，上机检测。

5. 统计学处理：各组间率的比较用χ2检验，各组间均数比较用t检验，方差分析用F检验。

结    果

1. HBV核心区第60位氨基酸（aa60）变异情况：参照我国HBV流行株（C基因型）标准序列[2]，进行核酸序列对齐比较。91例慢性乙型肝炎患者中19例（20.9%）发生aa60变异，为亮氨酸Leu被缬氨酸Val替代（即第2078位核苷酸C被G替代）。其中慢性轻度3例（14.3%)，中度4例(16.7%)，重度5例(21.7%)，重型7例(30.4%)。提示随病情加重aa60变异率增加，以重型肝炎组最高。

2．将慢性肝炎患者分为aa60变异株组和aa60野生株组，分别比较二组之间细胞因子水平、T细胞亚群分布的变化情况，aa60变异株组IFN-γ、TNF-α及IL-2水平均高于野生株组，其中变异株组的IFN-γ及TNF-α水平分别与野生株组比较，差异有显著性；同时变异株组CD4+相对数及CD4+/CD8+比值高于野生株组，CD8+相对数明显低于野生株组，其中CD4+/CD8+比值差异有显著性（表1、2）。

表1  aa60变异株组和野生株组血清细胞因子
水平的比较（x-±s，pg/ml）
组别 例数   IFN-γ  TNF-α IL-2
变异株组 19 53.3±14.8** 50.1±10.3* 31.6±13.3
野生株组 72 41.1±19.0 35.6±16.1 29.5±15.2
  IFN-γ：γ干扰素；TNF-α：肿瘤坏死因子α； IL-2：白细胞介素-2；与野生株组比较，* t′TNF-α=4.766，P<0.05；** tIFN-γ=2.584，P<0.01，tIL-2=0.553, P<0.01
表2  aa60变异株组和野生株组外周血T细胞亚群
分布的比较（x-±s，%)
组别 例数     CD4+     CD8+ CD4+/CD8+
变异株组 19 47.1±11.1 29.8±10.0 1.8±0.5
野生株组 72 45.9±14.2 35.0±16.2 1.4±0.7
  tCD4+=0.341，t′CD8+=1.731，tCD4+/CD8+=2.275，P<0.05

讨     论

　　HBV本身并不直接损伤肝细胞，病毒所激发的免疫应答和免疫病理反应才是乙型肝炎发病的关键，其中CTL是细胞免疫反应的主要执行者，是彻底清除HBV的决定因素[3，4]。

　　CTL可以通过分泌包括TNF-α和IFN-γ在内的多种具有抗病毒作用的细胞因子[5，6]发挥免疫效应。其中IFN-γ具有活化CD4+、CD8+及 NK细胞杀伤肝细胞的作用，是抗病毒防御效应的重要机制；而TNF-α则与肝细胞的坏死密切相关。因此CTL被活化后在发挥抗病毒效应时还能引起肝细胞的损伤甚至严重的肝衰竭。

　　目前国内关于HBV核心区基因变异的研究多集中在前C区A1896变异，有关C基因区变异及这些变异与机体细胞免疫水平关系的研究则鲜见报道。HBV核心区包含有多个T细胞识别的表位，其中aa48～60是重要表位之一，而aa60正位于其中（编码核苷酸为nt 2078～2080）。本实验通过对HBV DNA C基因区进行核苷酸序列分析，并同时检测患者外周血T细胞亚群及血清细胞因子水平，从而了解HBV核心区第60位氨基酸的变异情况及机体的细胞免疫状况，探讨在慢性乙型肝炎中HBV核心区aa60变异与机体细胞免疫水平的关系。实验数据显示Val60变异株在各慢性肝炎组均存在，且随着病情加重变异率有升高趋势，以重型肝炎组最高（但由于样本数少统计学分析差异无显著性）。同时变异株组IFN-γ、TNF-α水平明显增高，CD4+/CD8+比值逐渐升高，提示Val60变异株与病情加重和免疫功能异常密切相关。

　　Leu60Val变异与肝脏疾病的进展有关[7]。在机体的免疫应答中，T细胞对的识别主要集中在一个残基，它是T细胞反应的关键，仅仅单个氨基酸的改变，便可以影响抗原与HLA-I类分子的结合力，或改变TCR的识别效率；大多数突变分子的结合能力有一定下降，但少数突变分子的结合能力却可以显著增加[8]。本实验结果显示单个氨基酸残基的改变与疾病程度和免疫功能异常有明显相关性，提示可能是Val60变异株能够增加与HLA-I类分子的亲和力，或增强HLA-I类分子的表达，从而提高了CTL对宿主的杀伤力，临床表现为血清细胞因子水平及外周血T细胞亚群分布的变化。实验中还发现Val60变异株组还伴有CD8+细胞相对数明显下降及CD4+/CD8+比值升高。Webster等[9]实验发现在丙氨酸氨基转移酶（alanine amino-transferase，ALT）升高与不升高的慢性乙型肝炎患者的肝组织中HBV特异性CTL的数量没有差异，但ALT升高组的肝组织中T细胞的总数大大增加；而Maini等[10]提出慢性乙型肝炎患者的肝损害可能是由肝外聚集而来的特异性和非特异性的CD8+细胞。本实验结果显示Val60变异株可能增加了与HLA-I类分子的亲和力，或增强HLA-I类分子的表达，从而大大增强了CTL的活化增殖，在分泌较多数量IFN-γ、TNF-α的同时，众多CTL细胞聚集到肝脏中发挥免疫效应，损伤大量HBV感染的肝细胞。

　　变异的HBV病毒可能通过各种途径改变机体的免疫应答，引起HBV的持续感染或肝细胞损伤，甚至肝衰竭。因此同时监测HBV变异情况及机体免疫状况，有助于了解二者的相关性，为进一步阐明二者的因果关系提供依据。

参  考  文  献
1中华医学会传染病与寄生虫病学分会、肝病学分会. 病毒性肝炎防治方案. 中华肝脏病杂志, 2000, 8: 324-329.
2郭亚兵, 侯金林, 戴炜，等.乙型肝炎病毒中国株全基因参照序列初步建立. 中华微生物学和免疫学杂志, 1999, 19: 197-200.
3Ferrari C, Penna A, Bertoletti A, et al. Cellular immune response to hepatitis B virus-encoded antigens in acute and chronic hepatitis B virus infection. J Immunol, 1990, 145: 3442-3449.
4Milich DR, McLachlan A, Moriarty A, et al. Immune response to hepatitis B virus core antigen (HBcAg): localization of T cell recognition sites within HBcAg/HBeAg. J Immunol, 1987, 139: 1223-1231.
5Prezzi C, Casciaro MA, Francavilla V, et al. Virus-specific CD8(+) T cells with type 1 or type 2 cytokine profile are related to different disease activity in chronic hepatitis C virus infection. Eur J Immunol, 2001, 31: 894-906.
6Tomaras GD, Greenberg ML. CD8+ T cell mediated noncytolytic inhibition of human immunodeficiency virus type I. Front Biosci, 2001, 6: 575-598.
7骆抗先，主编. 乙型肝炎基础和临床. 北京: 人民卫生出版社, 2001. 65.
8余传霖, 叶天星, 陆德源, 主编. 现代医学免疫学. 上海: 上海医科大学出版社, 1998. 217.
9Webster GJ, Reignat S, Maini MK, et al. Incubation phase of acute hepatitis B in man: dynamic of cellular immune mechanisms. Hepatology, 2000, 32: 1117-1124.
10Maini MK, Boni C, Lee CK, et al. The role of virus-specific CD8(+) cells in liver damage and viral control during persistent hepatitis B virus infection. J Exp Med, 2000, 191: 1269-1280.