肝纤维化细胞外基质的组成

　　细胞外基质（extracellular　matrix；ECM）一般包括胶原、非胶原糖蛋白、蛋白多糖及弹性硬蛋白。ECM不是仅起支架作用的杂乱无章的静态堆积物质，而是组织有序、生物学活性多样的生命大分子。它们对细胞和组织的形态结构、新陈代谢、生长、分化都有重要影响。

　　（一）胶原

　　胶原（collagen）是细胞外基质的最重要成分，目前已发现至少19型胶原，但肝脏中含量较高者仅包括Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ、Ⅹ和Ⅷ型。正常人肝脏的胶原含量约为5mg/g肝湿重，Ⅰ/Ⅲ型胶原的比为1：1，各占33%左右；肝纤维化和肝硬化时肝脏胶原含量可增加数倍，且Ⅰ/Ⅲ型的比值可增加到3：1左右。根据胶原的结构和功能可将其分为7类：

　　1.纤维性胶原（fibril　forming　collagen）    这是最经典的胶原，如Ⅰ、Ⅲ、Ⅴ和Ⅺ型胶原。其肽链长达1000个氨基酸，是结缔组织中含量最丰富的胶原。前胶原三螺旋的端肽被切除后纵向平行排列，其中每个胶原分子纵向稍偏移，相邻的肽链形成共价键交联从而形成微纤维。一般需经前胶原肽酶（procollagen　propeptidase）将羧基端肽去除后才能形成胶原纤维，但是部分胶原可以带有氨基端肽而存在于胶原纤维的表面，以阻止胶原纤维继续增粗，从而继续起到调节胶原纤维直径的作用。

　　2.网状胶原（network　forming　collagen）    如Ⅳ、Ⅷ和Ⅹ型胶原，主要分布于基底膜中。与纤维性胶原不同，其端肽不被去除。两条Ⅳ型前胶原肽链的羧基端肽（NC1）端-端相连形成二聚体，四条前胶原肽链的氨基端肽（7S）端-端形成四聚体，从而相互交联成三维网状结构。在肝脏中，Ⅳ型胶原主要分布于血管和胆管的基底层，而且还分布于汇管区的成纤维细胞周围及正常肝血窦的Disse腔中。Ⅷ型胶原常与弹性纤维一起分布于肝脏的汇管区和包膜中，其功能尚不清楚。

　　3.微丝状胶原（microfilament　forming　collagen）     目前此组只包括ⅥM型胶原。其肤链较短，仅为纤维性胶原的三分之一左右。两条肤链反向平行排列，借端肤相互交联成二聚体，二聚体冉端-端相连聚集成四聚体。许多四聚体端-端相接形成状如串珠的微丝状长链。在肝脏中Ⅳ型胶原分布于汇管区基质和肝血卖Disse腔隙。Ⅵ型胶原通常分布在Ⅰ型和Ⅲ型胶原纤维之间，推测其功能是将血管结构锚定到间质中。最近发现Ⅵ型胶原对多种上皮细胞和间质细胞包括肝脏星状细胞的生长有促进作用，并可抑制细胞凋亡。

　　4.锚丝状胶原（collagen　of　aachoring　filament）Ⅶ型胶原属此组，其肽链三螺旋长达1530个氨基酸，中间穿插许多非胶原序列。两条前胶原肽链的羧基端肽端-端重叠交联形成二聚体，多个二聚体以羧基端交联区为中心侧-侧聚集成锚丝状纤维。这一纤维的两个氨基端肽连接到基地膜的某种分子上起锚定作用，故名。

　　5.三螺旋区不连续的纤维相关性胶原（fibril　associated　collagens　with　intenrupted　triplehelices；FACIT）这一组包括Ⅸ、Ⅻ、ⅩⅣ、ⅩⅥ及ⅩⅨ型胶原，而且其数目还不断增加。其本身不形成纤维，但与纤维性胶原纤维的表面相连。目前对这一组胶原的确切功能及组织、细胞分布尚不了解。ⅩⅣ型曾被称为粗纤维调节素（undulin），但现在认为其特征性结构为胶原三螺旋，故名ⅩⅣ型胶原。

　　6.跨膜性胶原（transmembrane　collagen）    如ⅩⅦ型胶原，它有一个细胞内非胶原区，一个跨膜区和细胞外胶原尾巴。这种胶原主要由皮肤基底角化细胞产生，在肝脏中未发现。

　　7.尚未分类的胶原：包括ⅩⅢ，ⅩⅤ和ⅩⅧ型胶原。ⅩⅢ型胶原主要分布于皮肤附属器、骨、软骨、横纹肌及肠道黏膜，但不见于肝脏。ⅩⅤ型胶原mRNA表达于许多组织和器官的成纤维细胞和上皮细胞。ⅩⅧ型胶原主要分布于肝脏、肺脏和肾脏。值得一提的是，原位杂交研究结果表明在肝脏中ⅩⅧ型胶原主要由肝实质细胞产生，显然与其它胶原主要由间质细胞产生不同。其羧基端具有抑制血管增生的作用而称为内皮抑素或内皮它汀（endostatin），初步体外和动物试验发现它对肿瘤有较强的抑制作用。

　　（二）非胶原糖蛋白

非胶原糖蛋白（noncollagenous　glycoproteins；GP）    为细胞外基质的另一重要成分，是一组在侧链N或O位带有糖基的蛋白分子，其分子中的多个功能区可与其它细胞外基质及多种细胞膜的跨膜蛋白受体结合，从而影响细胞的生长、分化、代谢等各种生物学行为。随着对其生化组成和分子结构的研究不断深入，目前已经很难截然区分胶原和非胶原糖蛋白及其它细胞外基质分子。如前所述，原来认为粗纤维调节素（undulin）属于糖蛋白，但现在认为应该属于胶原（ⅩⅣ型）。

　　1.纤维连接蛋白（fibronectin）　　纤维连接蛋白为二聚体，其两条链在羧基端有二硫键相连。其分子由多个功能区组成，可分别与细胞表面、细胞外基质分子（胶原、跨膜蛋白多糖、肝素及纤维蛋白原）及其受体完整素（intergrin）结合。它的分布十分广泛，几乎可见于所有的结缔组织。其功能也多样而且有的相互抵触，如细胞黏附、伸展及移行。纤维连接蛋白的基因含有许多个外显子，其新生RNA通过不同的剪接可表达出20种不同的mRNA并翻译出相应的肽链，因而从理论上可形成400种不同的二聚体，可能这种高度多样性正是为了适应不同组织器官在不同生理或病理生理状态下的功能需求。

　　细胞性纤维连接蛋白为不溶性多聚体，由间质细胞产生，其特点是带有一额外功能区 （extradomain）A或B，前者的功能为促进与细胞的结合，后者的功能为松解细胞与间质的结合而促进细胞的移行。它通过其细胞结合功能区与细胞表面的受体完整素结合，同时通过其它相应的功能区与胶原纤维、肝素等其它细胞外基质成分结合。它不仅像铆钉一样把细胞外间质连接成一体，而且通过完整素等分子与细胞骨架肌动蛋白相联系，这可能是细胞与细胞、细胞与基质之间传递信号的一种重要方式。

　　血浆性纤维连接蛋白为可溶性的二聚体，主要由肝细胞产生，其血浆浓度可达200-400mg/L。它们不含额外功能区，其亚单位的变化也不像细胞性纤维连接蛋白那样大。在组织损伤时，纤维连接蛋白与纤维蛋白结合并沉积于局部作为最早期的细胞外基质以促进修复。另外，纤维连接蛋白可与纤维蛋白、组织碎块、细菌等结合然后被单核吞噬细胞清除从而起到调理作用。

　　2.层连蛋白（laminin）　　层连蛋白是上皮、内皮、肌肉、神经等细胞和组织的基底膜之主要成分，其功能多样，包括维持细胞生长、分化和基因表达及细胞移行和肿瘤转移。它由α（约440000）、β（约220000）和γ（约210000）三个亚单位（以前分别称为A，B1和B2）构成。三个亚单位形成十字架结构，它们的氨基端分别形成三个短臂，其羧基端并列在一起形成长臂，在十字架中部和长臂末端有二硫键将三条链连接在一起。这些亚单位由不同的基因编码，现已知至少有5种α链，3种β链和2种γ链；它们可以组合成11种层连蛋白，其中1至7已得到证实。短臂可分为球形功能区Ⅳ（在β链中称为Ⅳ’）和Ⅵ及杆状功能区Ⅲ和Ⅴ。Ⅳ区的功能尚不清楚，Ⅵ对于层连蛋白形成多聚体至关重要，可能还具有结合肝素和细胞表面的位点。Ⅲ和Ⅴ区含有表皮生长因子样重复序列；另外小鼠α1和β1链的Ⅲ区分别含有YIGSR（酪-异-甘-丝-精）和RGD（精-甘-门）序列（均为细胞表面结合位点），γ1链Ⅲ区含有结合巢蛋白的位点，可能在基底膜中把层连蛋白和Ⅳ胶原连成网状结构。长臂可分为杆状功能区Ⅰ和Ⅱ，其中可能有细胞结合位点。另外α链羧基末端球形结构为功能区G，其中含有结合肝素、硫酸乙酰肝素、蛋白多糖及细胞表面的位点；功能区B为β链长臂中部一小的环状结构，它将功能区Ⅰ和Ⅱ分开，其功能尚不清楚，但推测可能对层连蛋白链的选择和组装过程中起作用，或者连接层连蛋白和其它基底膜成分。

　　3.巢蛋白（entactin，nidogen）    为基底膜的成分之一，其分子量为150000。可分为三个功能区，两端分别为呈球形的氨基末端Ⅰ区（较大）和羧基末端Ⅲ区（较小），及二者之间呈杆状的Ⅱ区，因而整个分子里不对称哑铃形。Ⅱ区主要由富含半胱氨酸的表皮生长因子样重复序列和甲状腺球蛋白样重复序列组成，它可结合钙离子并促进细胞黏合，但其主要功能是促进基底膜的装配。其羧基端球形Ⅲ区可与层连蛋白γ1短臂之Ⅲ区紧密结合，同时这一区还可与Ⅳ型胶原的羧基端肽80nm处结合，在层连蛋白和Ⅳ型胶原之间起桥梁作用。

　　4.健生蛋白（tenascin，hexabrachion，brachionectin，cytotactin）　　腱生蛋白家族至少有三个成员，即t-C，t-R，t-X，它们为不同的基因产物。t-R主要分布于神经系统，t-X主要分布于骨骼肌和心肌；而t-C被发现最早，也是通常所指的腱生蛋白，它分布于多种发育中的组织，包括神经组织，但不见于骨骼肌和心肌。腱生蛋白基因通过不同的RNA剪接而形成的六个亚单位，它们的氨基末端在中央由二硫键连接而形成六聚体。每一长臂带有与纤维连接蛋白（Ⅲ区）样和表皮生长因子样的同源序列，在近羧基端有细胞结合位点。它可通过与纤维连接蛋白上的同源序列竞争细胞受体而干扰和减弱其黏附功能。它和骨连接蛋白（osteonectin）及血小板反应蛋白（thrombospondin）均有促进细胞运动的功能，故有人将这三者称为“抗黏附分子”（anti-adhesive　molecules）。有研究发现，腱生蛋白-C基因敲除（knockout）小鼠发育生长正常，因而有人认为此分子可能无功能。但另一种可能的解释是，同一基因家族的其它基因可能起到了补偿作用才使小鼠发育正常。在正常肝脏中，仅少量腱生蛋白沿肝血窦断续分布，而肝纤维化时大量腱生蛋白沉积在结缔组织和肝实质细胞交界处；双重免疫组化技术显示肝星状细胞合成和分泌腱生蛋白，来自肝实质细胞的细胞系在体外培养中不产生腱生蛋白。

　　5.富含半胱氨酸的酸性分泌性蛋白（secreted protein，acidic and rich in cysteine；SPARC）　　曾因最早发现于骨组织中而又称骨黏连蛋白（osteonectin）；因其分子量为40000且可由小鼠分泌基底膜性肿瘤（basement　membrane-secreting tumor）产生，故又名BM40。SPARC可分为4个功能区，Ⅰ和Ⅳ区具有结合钙的位点，Ⅱ区与丝氨酸蛋白酶抑制物（serpin）、滤泡素抑制素（follistatin）有同源性，Ⅲ区为α螺旋结构。其含量在骨组织与血小板及成纤维细胞中较高。Nortliern　blot结果表明现在人、大鼠和小鼠肝硬化肝组织中SPARC　mRNA水平较相应正常肝组织明显升高，且随肝纤维化的消长而同步变化，组织原位杂交及体外细胞培养研究发现肝脏星状细胞是SPARC的主要细胞来源。其功能较为复杂，包括干扰细胞与细胞外基质的结合而改变细胞的形状、促进其移行，对血管增生和肿瘤转移的影响也已有许多报道。值得注意的是，它可以与血小板衍生的生长因子（PDGF）的β链结合而抑制其活性，因而似乎能够对抗其促进星状细胞增值和激活。但是另一方面，它还可以诱导Ⅰ型血浆纤维蛋白酶原激活因子的抑制物，因而可能抑制细胞外基质的降解过程。因此SPARC在肝纤维化、肝硬化的发生和发展中的确切作用尚有待深入研究。

　　6.血小板反应蛋白（thrombospondin；TSP）　　血小板反应蛋白为一基因家族，已发现了至少5种TSP，TSP1、2由3条相同的链经二硫键连接而成，TSP3、4、5由5条相同的条链经二硫键连接而成，呈扁椭圆形的“流星锤”样。最早发现于血小板的颗粒内，在血小板激活时释放出来。后发现许多增殖中的细胞也产生TSP，包括成纤维细胞、内皮细胞和平滑肌细胞。TSP分子中有许多结合位点，包括细胞表面，钙离子，纤维连接蛋白，层连蛋白，Ⅰ、Ⅴ型胶原，以及纤维蛋白原、纤溶酶原等。TSP对细胞增殖有轻度刺激作用，TSP1可能是TGF-β1在体内的激活剂。缺乏TSP2的小鼠之皮肤和肌腱发脆、强度降低，说明它对于胶原纤维的形成起重要作用。PDGF和bFGF及血清可以促进TSP的表达。对于肿瘤生长的作用，目前有两种截然不同的观点，即促进和抑制肿瘤。

　　7.玻连接蛋白（vitronectin）　　玻连接蛋白也是一种细胞黏附和伸展因子，存在于血浆和ECM中，由单体和二聚体两种形式。它可以和完整素受体结合，也可以和补体及凝血过程后期的一些蛋白结合，抑制细胞溶解。在止血、细胞吞噬、组织修复及免疫应答中起保护作用。主要由肝脏合成，但血小板、巨噬细胞和平滑肌细胞也可合成。在正常肝脏中，仅在汇管区见少量玻连接蛋白染色。而在慢性肝炎、肝硬化患者血清中玻连接蛋水平降低，但肝组织中玻连接蛋沉积增多，且主要分布于纤维间隔和灶状坏死区。免疫电镜观察提示玻连接蛋由肝细胞产生。

　　（三）蛋白多糖

　　蛋白多糖（proteoglycan）    是一类由蛋白质作核心骨架，在N或O位上连有糖胺多糖（glycosaminoglycan；GAG）侧链的大分子物质，它们与胶原一起分布于细胞外基质和基底膜上，同时也分布于细胞膜上。以前根据其糖胺多糖的不同分为硫酸乙酰肝素（heparan　sulfate）、硫酸皮肤素（dermatan　sulfate）、硫酸软骨素（chondroitin　sulfate）及硫酸角质素（keratan　sulfate）。正常肝脏中硫酸乙酰肝素含量最多，而肝纤维化时而硫酸皮肤素和硫酸软骨素的含量增加。透明质酸（hyaluronic　acid）没有经过硫化，也无蛋白骨架，但通常也与蛋白多糖一起被描述。近年倾向于根据其糖核心蛋白不同进行分类：

　　1.与细胞膜相关的蛋白多糖  其核心蛋白往往有跨膜功能区，有的则经其GAG侧链与细胞膜相连。它们含有大量的硫酸乙酰肝素和少量的硫酸软骨素，可与细胞外基质、生长因子、细胞黏附分子（CAM）及蛋白酶抑制物结合，能调节这些物质的活性。

　　（1）黏连蛋白聚糖（syndecan）：它是某些细胞外基质的受体，通过其GAG侧链可与Ⅰ、Ⅲ、Ⅴ型胶原、纤维连结蛋白及腱生蛋白相结合；同时还是bFGF的辅助受体（coreceptor）。其主要功能是信号传递，它可由肝组织及体外培养中的肝细胞产生。

　　（2）凝血调节蛋白聚糖（thrombomodulin）：由血管内皮细胞产生，其GAG侧链为硫酸软骨素。可与凝血酶结合，抑制纤维蛋白原和因子V的激活，从而调节血液凝固过程。

　　（3）蛋白聚糖（betaglycan）：其GAG侧链为硫酸软骨素和硫酸乙酰肝素。是细胞膜受体，对TGF-β有高亲和力，是它的Ⅲ型受体。

　　2.与细胞外基质相关的蛋白多糖  它们主要分布于细胞外基质中。

　　（1）纤调蛋白聚糖（fibromodulin）：其GAG侧链为硫酸角质素，可以调节胶原微纤维的形成。在肝脏中尚未发现。

　　（2）基底膜蛋白聚糖（perlecan）：由非实质细胞产生，分布于基底膜和胆管、血管。可与内皮细胞和肝细胞结合。

　　（3）核心蛋白聚糖（decorin）：其GAG侧链为硫酸软骨素和硫酸皮肤素。可与Ⅰ、Ⅳ胶原及纤维连结蛋白结合，延缓胶原微纤维的形成。它对调节TGF-β的生物活性有较大的作用。首先TGF-β可使核心蛋白聚糖的表达增加，而核心蛋白聚糖又反过来可使TGF-β灭活。在正常情况下星状细胞富含视黄酸，其核心蛋白聚糖表达较高，TGF-β的活性受到抑制；而在激活的星状细胞中视黄酸含量减少，核心蛋白聚糖的表达亦降低，因而对TGF-β的抑制作用减弱，更有利于纤维增生。

　　（4）双糖链蛋白聚糖（biglycan）：其GAG侧链为硫酸软骨素和硫酸皮肤素，由星状细胞和肌成纤维细胞合成。通过其核心蛋白与TGF-β结合，通过其GAG与bGFG结合。与核心蛋白聚糖相反，TGF-β可使其表达增高，而视黄酸可使其表达减低。

　　（5）多功能蛋白聚糖（versican）：其侧链为硫酸软骨素，PDGF和TGF-β可使其表达增加。它可与透明质酸结合。至于肝脏细胞是否可产生多功能蛋白聚糖尚无定论。

（四）细胞-基质黏附分子

广义的ECM还包括细胞-基质黏附分子（cell-matrix　adhesion　molecules）。细胞和细胞外基质成分之间的相互作用就是通过特定的质膜蛋白（即各种黏附分子）来实现的。一些在其它上皮细胞和内皮细胞上经常表达的黏附分子，在正常肝细胞和血窦内皮细胞中并不表达，但在纤维化的发生过程中这些黏附分子的表达增加。细胞-基质黏附分子主要包括整合素（integrin）家族和CD44蛋白家族。

1.整合素  整合素是由α和β链非共价结合组成的二聚体，现已知有17种α链和8种β链共组成21种有功能的二聚体。作为受体整合素可以结合多种配体，而一种细胞外基质成分可由多种整合素通过不同的识别位点结合。最重要的识别位点是细胞外基质分子中的R-G-D（精-甘-天）序列，大多数整合素受体皆可识别之。各种整合素有其特定的组织分布，但一种细胞可以存在多种整合素，其配体识别位点亦可有重叠。在非极性细胞上，整合素分布于各个面，在极性细胞只分布于基底面和侧面。它们不仅起黏附作用，而且因其细胞内功能区与细胞骨架相连，故可以传递信号，促进细胞的增殖、分化和移行。

2.CD44蛋白家族 这是一类大量糖基化的跨膜蛋白，广泛分布于体细胞，可以介导细胞-细胞，细胞-间质的相互作用。本家族的成员很多，在正常状态下，肝细胞内检测不到CD44蛋白的表达，但在血窦内皮细胞中可有表达。

黏附分子在肝纤维化过程中最显著的改变是肝细胞和血窦内皮细胞诱导表达层连蛋白受体（属整合素家族），而且其表达的上调早于肝硬化的形成。致纤维化的细胞因子如TGF-β和促进炎症的细胞因子如TNF-α、IL-1β、IFN-γ均可促进整合素和CD44蛋白的高表达。完整素受体的激活可以直接和间接地触发一系列的细胞内事件，如细胞的形态、分化、代谢、分泌、胞浆底物的酪氨酸磷酸化等，再次说明细胞外基质对于调节肝细胞和血窦内皮细胞的结构和功能起重要作用。在肝纤维化的早期，整合素的表达能促进细胞外基质在局部的沉积和排列，因而这种黏附分子表达增强的现象不仅是机体对细胞微环境改变的被动适应，而且有可能在启动纤维化本身的过程中起主动作用。