HBV感染综合免疫疗法

   全国HBV感染率近60%，其中HBsAg携带率为10%，大约有1.2-1.3亿人，现症患者3千多万，是我国肝硬化和肝癌的主要原因。乙型肝炎为危害我国人民身体健康的主要疾病。慢性乙型肝炎(CHB)采用抗病毒、调节免疫、改善肝功能和抗纤维化等综合处理，已为传染病医务工作者所接受。但目前抗病毒药物效果尚不能令人满意，检测手段落后，对患者免疫状况缺乏简单、准确和可靠的检测方法，以及缺乏从辩证观点看问题等诸多问题，往往出现顾此失彼、盲目用药的现象。如何根据临床、化验、机体免疫状况、综合分析、抓主要矛盾，个体化用药，制定合理的治疗方案，提高治愈率是至关重要的。
    一、乙肝病毒感染的自然病程：
    HBV感染可产生各种临床表现，从无症状的自限性感染到症状明显的各期肝病如急性肝炎、重型肝炎和肝硬化等。我国HBV感染率近60%，约1/3-1/2为亚临床感染，大多数表现为一过性自限性感染，不知不觉病毒清除而获得痊愈，仅少数出现明显的临床症状。感染HBV后，约90-95%可完全康复。转为慢性感染者也不过10%。新生儿、婴幼儿获得感染，由于免疫功能不健全表现为免疫耐受。HBV感染持续存在而任何临床表现(症状、肝功等)。我国HBV感染率明显高于西方国家。大约50%系在新生儿、婴幼儿期甚至宫内获得。多属垂直传播(母婴或父婴，以母婴传播为主)。大多数将成为慢性HBV感染者，相当一部分演变为肝硬化甚至肝脏细胞癌。感染后由于处于免疫耐受期(大约20-30年)而无任何临床表现即所谓的HBsAg携带者。经典的Burwet克隆选择学说认为，免疫耐受是指机体在胚胎期免疫功能成熟之前，接触外来抗原(如病毒)，机体视其为自身物质，针对该抗原起特异性反应的淋巴细胞克隆消失，不产生免疫应答。近来研究发现，新生儿、婴幼儿与发生免疫耐受的机制不同。新生儿和婴幼儿免疫耐受机制：
    1．经胎盘感染：过量的抗原表达，HBeAg在胚胎期进入胎儿体内，引起针对HBV的T细胞克隆缺失。
    2．抗原提呈细胞-DC功能下降：DC是体内最强的抗原提呈细胞，是唯一可直接活化T细胞的APC。70年代Steinman首次报导了DC，1992年从外周血分离培养出DC。DC在感染性疾病研究中受到越来越多的关注。研究表明GM-CSF(重组粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子)IL-4及肿瘤坏死因子等促进DC的分化，成熟。实验证明DC在免疫激发中有显著的作用。成熟的DC可高度表达MHC-I、II分子，提高刺激信号(CD80、CD86)及粘附分子，引起强烈的细胞免疫，达到清除病毒。有人在转基因小鼠实验中发现，DC的MHC-II和CD80表达极低。MHC-I类分子也明显低下，从而清除HBV能力下降。
    3．Th性T细胞应答功能低下。
    期发生感染其免疫耐受形成可能为：
    ①大量的病毒导致抗病毒CTL麻痹。
    ②抗病毒CTL由于对抗原的过强增殖反应而发生凋亡。
    ③抗原提呈细胞功能低下。耐受期过后或由于药物、饮酒等影响和机体免疫因素的原因，可突然出现肝炎的临床表现，酷似急性肝炎，如不仔细分析，错诊为急性肝炎。有人报告临床诊断的急性肝炎与肝活检结果的符合率不过50%。应引起临床的重视。
    二、抗病毒和免疫治疗应综合分析
    CHB慢性化的主要原因是宿主体液免疫、细胞免疫反应低下或无反应，致使HBV感染长期存在。肝脏细胞的炎症、坏死、纤维化等，虽不是HBV本身造成，但HBV可激发人体的免疫应答。所以HBV感染治疗的关键是抗病毒和调节免疫机能。目前公认的抗病毒药物有干扰素和贺普丁。干扰素有抗病毒、抗肿瘤和调节免疫的作用，而贺普丁为抑制逆转录酶活性，从而使双链DNA不能合成，而达到抑制病毒的作用。以上二药理想的适应症均为ALT升高伴有乙肝病毒复制指标(HBeAg和HBV-DNA)阳性的病人。完成全疗程达到完全应答(ALT复常，HBeAg和HBV-DNA阴性，抗-HBe阳转)者，IFN近期疗效不过30-50%。而且副反应亦颇多。贺普丁为核苷类药物，对HBV-DNA抑制率高(85%±)效果好，但停药后重新复制，HBeAg阴转率很低。姚光弼报告用药一年HBeAg阴转率9.5%，达到完全应答者8.5%，用药满二年分别为16.8%和11.5%。连续用药容易出现YMDD变异。1-4年治疗，变异率分别为14%、38%、49%、66%，随用药时间的延长，变异率逐渐增加，而且该药物对HBV复制模板cccDNA无作用。抗病毒治疗停止，血HBV-DNA会再次出现。从理论上讲，要做到病毒的彻底清除，要有长疗程抑制HBV-DNA的合成和清除cccDNA。治疗的时间要持续到cccDNA库存在的期限那样长。有人研究感染HBV的肝细胞的半衰期达100天，治疗一年能够减少感染细胞的数量最高是原始量的8%。这样长期的抗病毒治疗。将导致HBV的变异，副反应增多，价格昂贵也是一个现实问题。所以，目前使用的抗病毒药物不能令人满意。还需广大医务工作者、研究者努力探索，发掘祖国医学宝库，寻找更有效、适合我国国情、价廉、药源广、疗效高的药物。此外，我国尚有1.3亿的HBsAg携带者存在，这部分人群处于免疫耐受期，对HBV无反应性。对它们首先不是使用抗病毒药物，而是调节免疫打破免疫耐受，再结合抗病毒药物，可能会取得更好效果。2000年6月在日本召开的亚太国际肝病学术会议将CHB免疫病理分为三个阶段，即免疫耐受期、免疫清除期和病毒残留期。SALT正常而HBV高水平复制为免疫耐受期，SALT明显升高或反复波动为宿主免疫系统已识别并开始攻击肝细胞。SALT正常，HBV低水平复制为病毒残留期。2000年5月美国内科学会，在“慢性乙型肝炎感染，下一个千年的策略”文章中指出：慢性乙型肝炎治疗策略应当为抗病毒治疗+特异性免疫性治疗+非特异性免疫治疗的联合疗法。在我国慢性HBV携带者为数众多，免疫耐受期多不主张首先抗病毒治疗。当从免疫耐受期进入免疫反应期肝脏炎症活动，ALT升高。免疫反应过强，可导致肝衰竭。可采用高效价乙肝免疫球蛋白，中和HBV，减少复制水平，同时采用抗病毒药物，拉米呋啶和/或磷甲酸钠。为缓解非特异性免疫反应及病毒血症，也可用甘草甜素与胸腺肽联合应用。当免疫反应功能存在但尚不能清除病毒，病情迁延不愈时，这种难治性CHB单一使用调节免疫药物或抗病毒药物，效果不会理想，可采用联合用药治疗。如大剂量乙肝疫苗+佐剂+抗病毒药物治疗难治性CHB病例。因此，应根据患者的不同免疫状况和HBV复制水平，决定抗病毒和免疫治疗的主次或联合治疗。这方面我国学者已做了些探索和研究，取得了一定效果。北京医科大学感染科田庚善教授与北京地区其他专家共同制定的“左旋咪唑+潘生丁+乙肝疫苗”三联疗法。价格便宜，对HBeAg、HBV—DNA阴转都有一定的作用。解放军458医院全军肝病中心张宜俊等人根据患者的不同免疫状况，采用免疫疗法与抗病毒相结合、特异性免疫与非特异性免疫药物相结合，促进树突状细胞与T-细胞功能相结合的治疗方法，也取得了较好的效果。
    三、CHB的免疫治疗
    (一)特异性免疫增强剂——乙肝疫苗：
    乙肝疫苗接种是预防HBV的根本办法。国内广泛开展乙肝疫苗接种，使HBsAg携带率显著降低。上海由10.0%降至0.53%，北京由7.07%降至0.41%。这是乙肝防治工作的一个了不起的成绩。若干年之后我国HBV感染将会大幅度下降，达到控制或基本控制。能否用乙肝疫苗治疗HBV的感染，能否提高细胞免疫功能达到清除HBV的目的？目前国内外学者都在进行治疗性乙肝疫苗的研究。主要有HBsAg疫苗、HBsAg/前S疫苗、HBsAg复合物疫苗和HBV-DNA疫苗。这些疫苗多以HBsAg为主要免疫原。已有人将HBsAg疫苗用HBV转基因鼠，可使HBeAg和HBsAg转阴率大大提高。这些疫苗许多尚处于研制阶段，其中以HBsAg蛋白疫苗最有实用价值。闻玉梅教授等在鸭乙型肝炎模型中以金葡菌为固相基质吸附抗-DHBs，再吸附纯化的DHBsAg组建固相基质-抗体-抗原复合物(SMAA)来免疫DHBV感染鸭，每3周一次，共3，60-80%鸭DHBV-DNA转阴，50-60%DHBsAg转阴，并有部分鸭产生抗-DHBs。国外学者应用抗原抗体复合物(DHBsAg-抗-DHBs)免疫DHBV感染鸭，也使50%鸭清除血清中DHBV-DNA及DHBsAg，并认为不加佐剂的抗原抗体复合物免疫可使小鼠对相应抗原产生强烈的体液和细胞免疫。应用国产血源乙型肝炎疫苗与人乙型肝炎免疫球蛋白组成HBVac-HBIg疫苗(每单位含HBsAg60μg和HBIg38μg，以氢氧化铝为佐剂)接种14例CHB患者，每3周一次，共3次，6个月后有9例(64.3%)血清HBV-DNA转阴，6例(42.9%)HBeAg转阴。所有接受治疗者均未出现免疫复合物相关疾病的症状。实验证明，小剂量HBsAg疫苗(5-10μg)可诱导体液免疫应答，产生保护性抗体，实用于预防乙型肝炎，而大剂量(40-60μg)可诱导细胞免疫应答，有利HBV的清除。最近美国和澳大利亚分别批准以MF59为佐剂(代替铝佐剂)的乙肝疫苗与拉米呋啶联合治疗CHB。国内有人用大剂量HBsAg疫苗治疗CHB病人取得较好疗效。动物实验证明，大剂量乙肝疫苗可增加T淋巴细胞增殖，诱导Th1型细胞产生IL-2和IFN-γ，并能促进与细胞免疫相关的抗-HBsIgG2a产生，提高CTL的免疫功能。为乙肝疫苗治疗CHB提供了理论依据。
    国内早在“七五”、“八五”期间，应用乙肝疫苗加猪苓多糖治疗CHB取得了可喜的效果。但多年来乙肝疫苗应用缺乏科学的理论指导，使用方法缺乏规范化，剂量和疗程不统一。各学者评价不一。张氏提出的加大乙肝疫苗剂量(60μg)和长疗程(12个月)并联合其它非特异性免疫增强剂治疗CHB和HBsAg携带者的方案值得我们临床进行验证。
    关于大剂量乙肝疫苗注射的毒性作用。广州解放军四五八医院全军肝病中心易学瑞等人，以高剂量HBsAg疫苗对食蟹猴和小鼠中长期及急性毒性实验研究。在小鼠长毒实验中第三周起有个别动物颈背部(注射部位)有硬结。临床长期使用应引起注意。给药组动物可对受试疫苗产生免疫应答反应，血清中可检测到对应的抗体，部分动物可检测到IgG2a，停药4周，抗HBs仍然存在，IgG2a水平升高。剂量达6μg/只(约相当于300μg/kg，单次剂量为单次人临床拟用量的300倍，以体表面积计，约为单次人临床拟用量的24倍)。可对动物的肝功能有一定影响。未见明显迟发性毒性反应。本品多次给予小鼠(连续21次)的最大无毒作用剂量为3μg/支(约相当于150μg/kg)。单次剂量约为单次人临床拟用量的150倍。以体表面积计，约为单次人临床拟用量的12倍。以相当人临床用药量的42倍给食蟹猴注射，肝、肾出现轻度损害，停药可恢复。对食蟹猴的最大无毒作用剂量，相当人临床拟用量的21倍。实验结果提示60μg的乙肝疫苗在对人体是安全的。到底反应如何还有待今后进一步研究。
    (二)非特异性免疫增强剂
    1．胸腺肽——α1()
    为28个氨基酸组成的，人工合成，提高。据厂家介绍可增加内源性IFN-α和γ的分泌，提高IL-2水平和增加IL-2受体对IL-2的亲和力，增加淋巴细胞(CD3、CD4、CD8)的产生、分化和活化，可用于乙肝的治疗，但也有相反的报告。该药价格昂贵、效果一般，不适合我国国情。
    2．国产胸腺
    化学合成，分子量679，有促进和抑制双向调节作用，使免疫功能趋于正常。免疫增强作用表现为提高脾淋巴细胞E玫瑰花结形成率，增加巨噬细胞的吞噬功能，升高循环抗体的含量，活化CD4和CD8，增加CTL活性增加细胞内IFN的产生，可用于CHB的免疫调节治疗。国内有人用胸腺肽治疗CHB，60-80%患者的症状消失，肝功能试验复常，部分患者HBsAg阴转。应用胸腺肽与IL-2治疗CHB，结果联合组HBeAg、抗-HBcIgM和HBV-DNA的阴转率均高于对照组和单用胸腺肽或IL-2组。张氏采用大剂量(160μg)静脉点的方法，HBeAg和HBV-DNA阴转率均高于小剂量组。胸腺肽一般无明显不良反应，少数患者出现过敏反应，有寒战、发热、皮疹和皮肤瘙痒等。目前的问题是生产厂家诸多，国家缺少严格的规范标准，产品质量好坏不一，给临床带来困难。
    3、左旋咪唑
    全世界医学家在70年代及80年代，对左旋咪唑进行了大量的临床研究，证明是疗效肯定的免疫调节剂。提高免疫缺陷小鼠的抗体生成量，活化T细胞及单核细胞。动物和人体试验都证明能诱导IFN的产生。每天口服150mg3 -5天，有80%可见外周血单核细胞杀伤活性增强。慢性肝炎病人的NK细胞活性明显低于正常人，使用左旋咪唑后使NK细胞活性由51.45%提升至64.11%。说明可增强机体的免疫功能，有利HBV的清除。
    因口服左旋咪唑副反应较大，使其应用受到限制。为克服口服用药产生的不良反应。我国已生产出经皮吸收的涂布剂。经几年来的临床使用，证明对CHB、流感、过敏性哮喘、皮肤扁平疣等病毒性疾病均有一定的疗效。刘媛媛报告用左旋咪唑与一般保肝药治疗CHB 136例，疗程6个月。单一保肝药做对照。结果HBeAg、HBV-DNA阴转率分别为34.6%和41.3%。高于对照组。上海巫善明等报告CHB 117例，HBsAg、HBeAg、HBV-DNA有效率分别为2.6%、35.1%、43%，亦优于对照组。还有用左旋咪唑+乙肝疫苗+潘生丁的三联疗法。北京军区总医院和商丘市第五人民医院报告80例HBsAg携带者，使用三联疗法，观察时间6－18个月。结果HBeAg、HBV-DNA阴转率分别为54.41%、66.18%，而对照组HBeAg阴转率仅为7.78%，还有人用涂布剂联合拉米呋啶治疗慢性乙型肝炎，可提高HBeAg的血清转换率，值得临床错鉴和进一步验证。
    4、微卡(M·Vaccae)
    微卡是我国1999年批准生产的国家二类新药。它是用母牛分支杆菌经过高压破碎、高温处理制成的注射用冻干粉针剂。母牛分支杆菌含有高浓度分支杆菌类共同抗原。对人和动物无致病性。七、五期间，我国卡介苗和潘生丁联用治疗CHB，取得了较好的效果。该药是有双向调节作用。促进T细胞转化及增殖，改善患者的细胞免疫功能，CD3、CD4升高，CD8降低，增强吞噬功能，但由于卡介苗是减毒分支杆菌的活菌苗，有效期短(3个月)。而且容易引起局部溃疡、结痂及疤痕，因而限制了它的应用。微卡既克服了卡介苗的不良反应，又保持了其免疫刺激作用。成为替代卡介苗治疗CHB的药物。
    5、绿脓杆菌菌毛制剂 (佰安)：
    绿脓杆菌菌毛制剂系一种非特异性免疫增强剂。在体外刺激淋巴细胞活化，促使PBMC表达CD2、CD25、CD69细胞明显增加，若与HBsAg合用，对上述功能具有协同作用，此外类似佐剂，能促使HBsAg在多次高剂量免疫条件下诱生与细胞免疫有关的IgG2a类抗HBs。可活化T细胞功能。80年代—90年代大连医学院微生物教研牟希亚教授，在艰苦的条件下反复实验，制成了含有缘脓杆菌I、IV型菌毛的绿脓杆菌制剂。由南方某公司开发生产，商品名为绿幕安注射液。实验证明上述增强免疫的作用。我院在2000年使用绿幕安和绿幕安+1FN-α2b治疗CHB 30例和HBsAg携带者89例，一般护肝为对照，疗程6个月。结果CHB和携带者组HBeAg、HBV-DNA阴转率分别为43%(13/30)、50%(15/30)和(29/89)32.7%，(35/89)39.3%，均优于对照组。证明了绿幕安的促进免疫反应的作用。后来海南微克西药业有限公司又制成了含有I、II、IV型菌毛的绿脓杆菌制剂(商品名佰安)。因增加了II型菌毛成分，使其免疫效果较绿幕安更加明显。张宜俊等人用佰安+乙肝疫苗+胸腺肽对在免疫耐期的HBV感染者42例进行治疗。先用3－6个月的免疫治疗，再加用拉米呋啶。结果HBeAg阴转率、HBeAg/抗HBe转换率，HBV-DNA阴转率分别为26.2%、19.1%和54.8%，较单用拉米呋啶的HBeAg(4.8%)阴转率、血清转换率0%和HBV-DNA(28.6%)阴转率有明显提高。提示三联疗法对启动免疫，打破免疫耐受有一定作用。对免疫耐受期的HBV感染者的治疗带来一线希望。
    四、免疫疗法方案
    摘自2003年元月广州慢性乙型肝炎免疫治疗学术研讨会论文汇编14页。
    1、免疫耐受期：
    治疗原则：先应用免疫疗法3－6个月后，再应用抗病毒治疗。
    免疫疗法方案：乙肝疫苗+胸腺肽+黄芪注射液或乙肝疫苗+胸腺肽+含I、II、IV型菌毛的绿脓杆菌制剂(佰安注射液)
    乙肝疫苗60μg，肌注，每月1次×12。
    胸腺肽120mg加入10%葡萄糖液静点，每周3次×3－6个月，或胸腺肽40mg，肌注每周2－3次×3－6个月。
    黄芪注射液40ml加入10%葡萄糖液静点，每周3次×2－3个月。
    佰安注射液1ml，皮射，每周1次×3－6个月。
    抗病毒药物：1FN-α或拉米呋啶(常规剂量及用法)。
    2、免疫清除期：
    治疗原则：免疫疗法+抗病毒药物+护肝
    方案：乙肝疫苗+佰安注射液或胸腺肽+1FN-α或拉米呋啶+促肝细胞生长素
    3、病毒残留期：
    乙肝疫苗60μg，肌注，每月1次×12－24个月。
    4、HBV-DNA、HBeAg、HBsAg检测均采用定量分析，每3个月一次。