骨肿瘤病理诊断的进展

       骨肿瘤病理是病理学的一个分支，它研究来源于骨及其附 属组织肿瘤的病因、发病机制及病理形态变化，是一门发展迅 速的基础学科。它的发展一方面是细致的形态学观察所得到 的理论上的进展，另一方面是高度精密的仪器和先进的实验方 法以及多学科间的相互渗透所取得的方法学上的进展。使人 们对骨肿瘤病理从微观到亚微观的组织形态特征、分子生物学 、分子遗传学等诸多方面对骨肿瘤的发生、发展及转归有进 一步的认识，为骨肿瘤的诊断、治疗、转归及预后的评估提供 可信赖的依据。

　　一、骨肿瘤病理研究方法的进展

　　(一)光镜及电镜

　　研究骨肿瘤病理形态的经典方法是依靠肉眼的大体观察以 及光镜下的组织及细胞学观察。组织化学染色是反映细胞和组 织内各种蛋白质、酶、核酸、糖原等化学成分的状况，加深 对形态结构的认识。20世纪中期，超微病理迅速发展将肿瘤的 研究推向亚微观，骨肿瘤的超微结构或多或少具有来源组织的 超微结构特征，因而，可以借助这些特征探测肿瘤的来源。 如在骨的牙釉质瘤中见到上皮性细胞的连接器，推测其来源于 上皮组织。又如恶性小圆细胞肿瘤可能为Ewing肉瘤、恶性淋巴 瘤、骨髓瘤、小圆细胞型骨肉瘤、神经母细胞瘤、胚胎性横 纹肌肉瘤、滑膜肉瘤或低分化癌等，要区别它们有时十分困难 。而它们却有各自的超微结构特征，如Ewing肉瘤细胞内有大量 的糖原颗粒；恶性淋巴瘤有各阶段的淋巴细胞的超微结构特 征，无糖原颗粒，无内分泌颗粒；神经母细胞瘤细胞有树突样 突起，细胞内有微管及神经内分泌颗粒；胚胎性横纹肌肉瘤 细胞胞质内有肌丝、Z带和结构发育不良的肌节；骨髓瘤细胞 内有大量的粗面内质网；低分化癌有时可见细胞连接器。上述 特征均有利于鉴别诊断。

　　(二)免疫组织化学技术

　　60年代兴起的免疫组织化学技术经过多年的研究已建立起 各类细胞及相应肿瘤的免疫表型，并广泛应用于病理诊断，近 年来也已用于骨肿瘤。骨组织起源于中胚层间叶组织。骨组 织包括骨、软骨、骨膜以及其附属的血管、神经等，因此，原 发于骨的肿瘤来源复杂，其免疫表型除共同表达有别于上皮 来源的波形蛋白外，还有各自的特异性标记物。

　　成骨性肿瘤免疫表型表达波形蛋白，Ⅰ、Ⅲ型胶原，骨连 接蛋白，骨钙蛋白和碱性磷酸酶。由于骨钙蛋白只有成骨细胞 分泌，因此可作为成骨性肿瘤的特异性标记物。除骨钙蛋白 外，其余均无肯定的鉴别意义。偶尔，骨肉瘤可表达结蛋白和 a－SMA，说明它向肌组织分化。恶纤组型骨肉瘤还可表达CD68、 AACT和溶菌酶，软骨母细胞型骨肉瘤更表达S－100蛋白。当骨肉 瘤表达角蛋白时说明肿瘤分化极低。
 
        成软骨性肿瘤的免疫表型为波形蛋白、S－100蛋白、Ⅱ型 胶原，但无法与含有软骨成分的其它病变相鉴别，如骨化性肌 炎、骨痂等。间叶性软骨肉瘤还可表达NSE和Leu7；去分化软 骨肉瘤的免疫表型应包括软骨肉瘤和去分化肉瘤组织两部分； 纤维组织性肿瘤表达波形蛋白；非骨化性纤维瘤还表达AAT、A ACT、溶菌酶；神经组织性肿瘤表达S－100蛋白、神经元特异性 烯醇化酶(NSE)、神经丝蛋白(NF)、突触素(synaptophsin)、嗜铬颗粒 蛋白(chromagranin)、胶原纤维酸性蛋白(GFAP)；血管组织来源肿瘤 表达第Ⅷ因子相关抗原F8、CD43；组织细胞来源肿瘤表达AAT、A ACT、CD68、溶菌酶，肌肉组织肿瘤表达肌动蛋白、肌球蛋白、 肌红蛋白；Ewing肉瘤表达O13；恶性淋巴瘤表达LCA等。

　　免疫表型表达的强弱因肿瘤的分化程度不同而异，低分化 肿瘤免疫表型弱表达或不表达。肿瘤标记物的检测有助于确定 肿瘤的来源及骨内转移性肿瘤的原发部位。现在，坚硬的骨 组织经脱钙后也可做免疫组化染色，仅少数抗原(CEA，EMA)在 强脱钙剂下可能丢失其抗原性。

　　(三)流式细胞分析术（flow－cytometry，FCM）

　　流式细胞分析术是现代分析细胞学的主要研究方法之一， 通过它可获得细胞成分和细胞生化代谢的定量资料，已在临床 医学中成为快速、有效、客观、多参数和定量单细胞分析研 究的有力工具。骨肿瘤实质性肿瘤细胞DNA倍体类型的研究以及 骨肿瘤细胞增殖特性的定量学研究反映骨肿瘤细胞内在固有 恶性程度，可用于评估患者预后，尤其在肿瘤早期。但目前该 技术要成为临床常规检查项目尚有困难，也不能仅依据流式 细胞分析的结果作出临床诊断，应密切结合病理学的检查。曾 报道应用流式细胞分析术对未经化疗的骨肿瘤石蜡标本细胞D NA进行检测发现良性骨肿瘤和瘤样病变均为二倍体，无异倍体 ，恶性骨肿瘤异倍体发生率高。肿瘤的活检和大体标本、原发 和继发病灶均表现出稳定的倍体类型。骨肉瘤分型、分级在D NA含量上无明显的区别。有意义的是骨巨细胞瘤DNA倍性检测 发现，Ⅲ级骨巨细胞瘤为异倍体，少数Ⅰ级骨巨细胞瘤DNA出 现异倍体，骨巨细胞瘤的DNA含量增高，DI/PI值明显表现出与它 的恶性度呈正相关，这正符合骨巨细胞瘤为一潜在恶性的肿 瘤。骨肿瘤异倍体的发生有其重要意义，可以认为DNA异倍体是 恶性骨肿瘤的特异性标志，潜在恶性与恶性肿瘤有较多机会 出现异倍体，肿瘤的恶性度愈高，异倍体发生的机率愈大，但 二倍体骨肿瘤不否定恶性。
　    用流式细胞仪测定骨肿瘤凋亡细胞百分比，发现不同恶性 骨肿瘤患者对不同化疗药物、同一肿瘤的不同个体对同种化疗药物均有不同的肿瘤细胞凋亡比例，说明不同的化疗 药物对恶性骨肿瘤的凋亡诱导作用各不相同。传统的骨肿瘤 化疗敏感检测方法或易出现假阴性，或费时、费力，且易受免 疫排斥反应等因素影响，均不理想。目前，应用流式细胞仪 测定骨肿瘤凋亡细胞百分比，进而推算被测药物的化疗敏感性 ，具有方法简单、快速、灵敏及特异性等优点，可常规用于 指导临床选择敏感的化疗药物，制定更理想的个体化化疗方案 。

　　(四)原位分子杂交技术

　　原位分子杂交技术是将分子杂交与组织化学结合的一项技 术，它用标记的DNA或RNA探针在原位检测组织细胞内的特定的DN A或RNA序列。电镜原位杂交更具定位精确可靠，又可同时观察 细胞超微结构的特点，从分子生物学的角度认识细胞基因水平 的改变与细胞超微结构变化的关系。原位杂交技术已较广泛 的应用于骨肿瘤的分子病理诊断，探求恶性肿瘤细胞的来源， 研究基因表达、突变、丢失、插入对肿瘤细胞分化、分裂、 受体特性的影响以及恶性变及转移的关系。此外，原位杂交检 测骨肿瘤标记物mRNA，对肿瘤的早期诊断和治疗均有重要意义 。

　　掌握上述各种技术，尽可能地避免出现假阳性和假阴性。 多种技术可同时做，也可以先后做。Micram提出，各种技术迭成 金字塔形，金字塔的底部为光镜及电镜，中间层为组织化学 、免疫组织化学和FISH技术，顶层为细胞遗传、流式细胞分析 术和PCR技术。必须要求每种技术的操作标准化，结果准确，否 则会得到矛盾的结果，反而干扰诊断。

　　(五)骨肿瘤基因表达的研究

　　近年来，骨肿瘤的分子遗传学研究主要集中在骨肉瘤和骨 巨细胞瘤，进展较快，方法先进、精确，包括癌基因的扩增和 抑癌基因的突变等，它们在骨肿瘤的发生、发展的不同阶段 起着不同的作用。

　　1.癌基因

　　(1)SAS(sarcoma amplified sequence)基因:在一些软组织肿瘤中有明 显的扩增，并与肿瘤的生长、转移有关。骨肉瘤SAS的扩增表明 肿瘤的高度恶性。

　　(2)MDM2(muri nedouble minute2):MDM2是一种进化保守基因，具有 转录因子的功能。它与p53蛋白结合使p53功能失活[1]。在骨肉 瘤中MDM2的扩增与p53失活同时存在，研究MDM2在骨肉瘤中的 扩增有助于阐明缺乏p53基因改变的各类遗传机制，并提供诊 断和基因治疗的靶标。MDM2的扩增尤其多见于复发和转移的骨 肉瘤，因此，可以此估计骨肉瘤的预后。
(3)c－myc基因:c－myc基因在恶性骨肿瘤中明显表达。骨肉瘤 中c－myc基因的扩增与肿瘤细胞的生长和分裂有关。恶性、进 展迅速、有转移倾向的骨肉瘤患者c－myc基因扩增伴Rb基因位 点结构的改变，说明c－myc基因扩增和Rb基因结构改变对骨肉 瘤的形成和发展起重要作用。

　　(4)ras基因:ras基因在骨肉瘤、软骨肉瘤、骨巨细胞瘤中均 有高表达，提示ras基因激活与促进恶性骨肿瘤细胞的侵润及转 移有关。而ras基因活化又与Ⅳ型胶原酶的高表达有密切联系 ，因此认为这种改变可能是ras基因促进肿瘤细胞侵润转移的分 子调节机制之一。

　　(5)c－fos基因:恶性骨肿瘤有强表达的c－fos基因，提示肿瘤 的快速增殖。发现c－fos基因蛋白表达与大部分骨肉瘤的侵润 性生长有关，并促使骨肉瘤细胞产生各种遗传学变化。骨肉 瘤的发生需要一定的c－fos基因水平。

　　2.抑癌基因

　　随着分子遗传学的迅速掘起，人们逐渐认识到肿瘤的发展 是一个涉及多种基因的复杂过程。特别是与控制细胞正常生长 和分化的基因受到损伤而变异有关。这种损伤积累导致了癌 基因的激活和抑癌基因的丢失或失活，抑癌基因的功能丢失和 癌基因的表达是肿瘤发生的主要原因。

　　(1)Rb基因:Rb基因是一种抑癌基因。检测了骨肉瘤、软骨肉 瘤、恶性纤维组织细胞瘤以及骨巨细胞瘤，发现Rb基因缺失、 片段大小改变，以骨肉瘤的变化最为明显，约43％的骨肉瘤显 示Rb基因结构、功能异常。Rb基因功能失活的机制可能有基因 全部或部分丢失、基因重排、点突变等，从而不能正常编码Rb 蛋白；Rb基因结构虽正常，但转录调节、转录后的修饰或翻译 异常，不能产生Rb蛋白或产生异常Rb蛋白；Rb基因活性受到抑制 。应用免疫组化法检测骨肉瘤中Rb基因表达常低于正常骨组织 ，骨巨细胞瘤的Rb基因与其分级呈负相关。Rb蛋白可能是一个 细胞对环境抑制信息作出反应的中间环节，Rb基因丢失使细胞 对外界的抑制信息失去反应能力，造成细胞无