IgH、TCRδ基因重排与急性非淋巴细胞白血病的相关性

　【摘要】　目的　探讨初诊急性非淋巴细胞白血病(ANLL)患者中免疫球蛋白重链(IgH)和T细胞受体δ链(TCRδ)基因重排情况。方法　用聚合酶链反应方法检测IgH及TCRδ基因重排。结果　30例患者中9例(30%)发生IgH基因重排，5例出现TCRδ基因重排。结论　ANLL中确实存在系列不保真现象：不仅具有较高的IgH重排发生率，还具有TCRδ重排发生。

　　目前认为，当多能造血干细胞向淋巴细胞系定向分化时可发生免疫球蛋白重链(IgH)、T细胞受体(TCR)基因特异性重排，因此，重排的IgH、TCR基因可作为淋巴细胞克隆标志。然而，上述特异性重排发生在急性非淋巴细胞白血病(ANLL)中的报道已陆续出现［1-5］。但初诊患者中的发生率及其相关临床意义仍有待进一步研究。我们用聚合酶链反应(PCR)方法对30例初诊ANLL患者进行了IgH、TCRδ基因重排的检测，并就相关问题作了探讨。

病例和方法

1　病例　经形态学和免疫学确诊的ANLL患者30例，FAB分型中M16例，M26例，M312例，M42例，M53例，M61例。均为初诊患者。

2　免疫分型采用细胞间接免疫荧光进行标记，Epics XL型流式细胞仪(Coulter, USA)检测。所用单克隆抗体T系列为CD2、CD3、CD7；B系列为CD10、CD19、CD22；髓系系列为CD13、CD14、CD33；干/祖细胞抗原为CD34。均购自Immunotech公司。第二抗体为异硫氰酸荧光素(FITC)标记的羊抗鼠免疫球蛋白，购自军事医学科学院。结果判定：CD34细胞阳性率>10%为阳性指标，其余抗原阳性细胞>20%为阳性标准。

3　寡核苷酸引物选择　根据PCR引物设计原则，参考文献［4，6］设计如下引物：①针对IgH CDR-Ⅲ区域、Ⅴ区和J区的共同保守序列的引物A和B，引物序列：A：5′-ACACGGCCGTGTATTACTGT-3′；B：5′-ACTCTAGAGGAGACGGTGACC-3′。②针对TCRδ基因重排所产生的DNA片段，引物序列为：A：5′-GTGTGTATTTGTGGCCTTCAGCTAC-3′；B：5′-AAATGCTAGCTATTTCACCCA-3′。以上引物均由上海Sagon公司合成。

4　标本来源为骨髓细胞。DNA提取见文献［7］。

5　PCR反应及产物检测　反应体系为50μl，Taq DNA聚合酶2.0U(Sagon),0.5μg DNA模板，100mmol/L dNTP，引物各100ng。针对IgH的PCR反应条件为94℃ 30s,56℃ 45s,72℃　105s，共32个循环［5］。针对TCRδ基因重排的PCR条件为94℃ 60s，56℃ 60s， 72℃ 120s，共35个循环［6］。取扩增产物6μl，20g/L琼脂糖凝胶，TAE电泳，EB染色，紫外灯下观察结果。

结果

1　IgH重排　30例患者中9例PCR检测阳性，阳性率为30.0%。PCR特异性产物约为110bp，不同个体间产物亮度略有差异，且较急性淋巴细胞白血病(急淋)阳性标本为弱。阳性标本在FAB分型中的分布为M12例，M22例，M34例，M51例。

2　TCRδ重排　30例患者有5例出现特异性阳性区带，片段大小约190bp。FAB分型：M12例，M2　2例，M31例。

3　30例患者中随访16例(M12例，M23例，M39例，M41例，M51例)，其中4例IgH阳性；1例TCRδ阳性；1例M1IgH、TCRδ双阳性。 除M3用全反式维甲酸诱导缓解外，余均用以柔红霉素(30～60mg/m2)、阿糖胞苷(100～200mg/m2)为主的DA方案诱导缓解。按照目前临床普遍接受的标准：两个疗程以上强烈化疗未获缓解即为难治性白血病［8］，6例阳性患者中，只有1例双阳性者为难治性白血病；10例阴性者中2例达到这一标准。

4　30例患者中出现淋系相关抗原的有6例。它与FAB分型及IgH/TCRδ重排间的关系见表1。

讨论

　　白血病分型已从一般形态学和免疫学分型进入基因分型。通过设计引物扩增IgH基因重排产生的CDR-Ⅲ序列和TCR基因重排序列，可作为临床诊断急性淋巴细胞白血病恶性增殖的指标。但近来发现，IgH和TCR基因重排也可在其它分化系列的细胞上出现，如Rovigatti等［1］在ANLL 14例中利用Southern杂交发现2例具有IgH基因重排，此即系列不保真(lineage infidelity)［9］。最近有文献报道，利用PCR方法也发现了ANLL中出现IgH基因重排和TCRγ基因重排，但各家报道不一。陈冬梅等［3］在17例初诊ANLL患者中发现2例，徐兵等［4］在29例初诊ANLL患者中发现4例IgH基因重排，我们利用Kyoda等［5］设计的反应条件，对30例ANLL患者进行了IgH的PCR检测，结果不仅证明IgH重排并不局限于淋巴系统肿瘤，同时发现其在ANLL中的表达可能远高于文献的报道，达到了30%，而Kyoda等则达到了40%(共35例)，说明随着检测手段的改进以及灵敏度的提高，这种系列不保真现象的发生率可能较目前所知的更高。

表1　出现阳性的淋系相关抗原与FAB分型及IgH/TCRδ
重排的关系

出现阳性的
淋系相关抗原 例数 FAB分型 基因重排
　　CD2 2 M3 IgH
　 　 M5 (-)
　　CD7 2 M1 IgH及TCRδ
　 　 M1 (-)
　　CD2、CD7 1 M2 TCRδ
　　CD19 1 M2 TCRδ

　　关于TCR基因重排在非淋巴细胞白血病中发生的现象，Schmist等［2］曾对ANLL 100例进行的Southern分析发现9例具有TCR基因重排，陈冬梅等［3］利用PCR方法在17例初诊患者中发现了3例具有TCRγ基因重排。我们利用该法对初诊ANLL患者30例TCRδ的基因重排进行了检测，结果发现5例阳性，与陈冬梅等TCRγ基因重排的检出率基本相同。

　　如何解释这种系列不保真现象，各家说法不一。多数学者认为，可能恶性克隆最初发生在多能干细胞阶段，但肿瘤本身更促使变化了的多能干细胞向髓系定向发展，因此从形态学角度，细胞仍以髓系特点为主。Greaves等［9］对他及其它研究小组发现的淋、髓两系中系列不保真现象进行总结，认为在排除技术因素后，那些确实具有系列不保真现象的标本，不是因为细胞内基因发生了错排，而是因为正常多能干细胞中本身存在着短暂的基因表达混杂现象(promiscuity)，上述患者中，由于成熟障碍致使原始的白血病细胞保留了上述混杂现象的痕迹。从30例ANLL患者的免疫表型也可看出，这些患者有6例出现了淋巴细胞系相关抗原。当然，值得注意的是，这种免疫表型的“不保真性”与IgH/TCRδ重排间并无明显的相关性，其原因有待进一步了解。

　　上述系列不保真现象是否具有一定的临床意义针对可随访的16例患者所做的治疗效果分析未显示出统计学差异(P=0.5)。但观察例数较少。同时，治疗方案的不同(如M3多使用全反式维甲酸治疗，余病例则用ANLL相关的化疗方案)也掩盖了患者白血病细胞生物学特性的差异。值得注意的是：仅1例IgH、TCRδ双阳性患者表现出明显的难治性白血病特点，我们在另一组慢性粒细胞白血病患者中发现1例患者具有IgH重排，其在接受异基因造血干细胞移植后6个月以急淋变的形式复发。Kyoda等［5］对35例ANLL的观察也提示IgH重排阳性组较阴性组生存期长(P=0.2)。还有文献报道在ANLL缓解期中发现IgH重排的出现并可预测微小残留病变［3，4］。这些结果均表明系列不保真现象的临床价值不容忽视。

　　总之，作为B、T急淋基因分型的重要标志的IgH、TCR基因重排确实存在系列不保真现象。一方面，它提示我们IgH、TCR基因重排可能不宜作为ALL的绝对指标。同时，它为分子水平的杂合性白血病的诊断提供了依据。另外，在理论上，它也为研究白血病在造血细胞分化阶段的发生提供了新的资料。